高羊茅黔草1號和黔草2號LEA3基因克隆與苗期干旱脅迫表達

楊琴琴，胡 江，牛 熙, 2*，黃世會，冉雪琴，王嘉福, 2，王江嵐，令狐紹進，呂 婷，李 騁

(1.貴州大學 農(nóng)業(yè)生物工程研究院/生命科學學院, 貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點實驗室/山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點實驗室, 貴州 貴陽 550025；2.貴州省山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程2011協(xié)同創(chuàng)新中心, 貴州 貴陽 550025；3.貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025)

【研究意義】高羊茅(Festucaarundinacea)作為世界重要的草坪草和優(yōu)質(zhì)飼草備受學者重視，黔草1號和黔草2號屬貴州本地高羊茅品種，是貴州省農(nóng)業(yè)科學院草業(yè)研究所利用貴州野生高羊茅資源培育而成。前期研究發(fā)現(xiàn)，黔草1號和黔草2號高羊茅表現(xiàn)出較強的抗逆性，且黔草1號的抗旱性強于黔草2號[1]。目前國內(nèi)外學者在高羊茅抗逆性的研究方面取得較大進展，但主要針對其在干旱等逆境脅迫的生理變化，以及內(nèi)生真菌和植物生長調(diào)節(jié)劑等對高羊茅抗性的影響等，在其抗逆基因的分離克隆、表達調(diào)控等分子機理研究方面極少報道。因此，開展高羊茅抗旱基因研究對其抗旱機理研究具有重要的理論意義。【前人研究進展】晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白(late embriogenesis abundant protein，LEA)是植物抗旱性相關(guān)蛋白，在植物種子胚胎發(fā)育后期大量積累，當植物受到干旱脅迫時，這類蛋白因具有高親水性，在面臨干旱脅迫時能夠捕獲足夠的水分以保護細胞不受傷害[2-5]。根據(jù)氨基酸序列同源性及保守結(jié)構(gòu)域基元，LEA蛋白可分為6組[6-7]，其中，第3組LEA(LEA3)的結(jié)構(gòu)特征最為明顯，序列保守性強，具有一段串聯(lián)重復排列，該序列含有多個的基元序列，每個基元序列包含11個氨基酸(T/AA/TO/EA/TA/TK/RQ/EDK/RA/TXE/DQ)[8]。該基元序列可形成親水的α-螺旋結(jié)構(gòu)，在植物受到干旱脅迫時能防止組織過度失水，同時避免細胞內(nèi)高濃度離子積累引起的細胞損傷[9-10]。【本研究切入點】目前，已有報道在多種植物中克隆得到LEA3基因[11-19]，但對于黔草1號和黔草2號LEA3基因的結(jié)構(gòu)特點及其與植物抗旱性的關(guān)系不甚明了。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用RT-PCR克隆獲得黔草1號和黔草2號LEA3基因cDNA序列，并進行生物信息學分析，探索其進化保守性及在苗期干旱脅迫下的表達情況，為進一步探討高羊茅LEA3基因結(jié)構(gòu)及其抗旱性之間的關(guān)系提供依據(jù)，也為高羊茅抗旱機理的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

高羊茅品種黔草1號(代碼QC1)和黔草2號(代碼QC2)，貴州省農(nóng)業(yè)科學院草業(yè)研究所提供。試驗菌株為大腸桿菌(EscherichacoliDH5α)，貴州大學農(nóng)業(yè)生物工程研究院動物分室儲藏并提供。主要試劑，pMD19-T Vector試劑盒、PrimeScriptTMRT reagent kit和SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；植物基因組RNA提取試劑盒、2×Taq PCR Mastermix試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒和普通小型質(zhì)粒DNA提取試劑盒均購自天根生物科技北京有限公司。引物和核苷酸序列測定由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 高羊茅品種LEA3基因克隆 試驗于2019年3月在貴州大學農(nóng)業(yè)生物工程研究院動物分子與基因工程實驗室進行，分別剪取1 g生長2年的黔草1號和黔草2號葉片凍存于-80 ℃冰箱，用于RNA的提取及LEA3基因的克隆。

1.2.2 高羊茅品種苗期干旱脅迫LEA3基因表達 試驗于2019年3月在貴州大學農(nóng)業(yè)生物工程研究院動物分子與基因工程實驗室進行。采用牛熙等[1]的方法，對黔草1號和黔草2號種子進行消毒，于室溫下播種于塑料花盆內(nèi)(口徑為25 cm，高25 cm)。在25 ℃環(huán)境下萌發(fā)3 d后，選擇長勢一致的幼苗，置于Hogland營養(yǎng)液中進行液體培育8 d，之后將幼苗分別移入-1.5 MPa、-2.5 MPa 2種不同水勢的聚乙二醇6000(polyethylene glycol 6000，PEG 6000)溶液(用Hogland營養(yǎng)液配制)進行根際干旱脅迫處理(PEG脅迫)，分別采集脅迫后0、1、2、3和4 d的葉片組織1 g，液氨速凍，并保存在-80 ℃冰箱。3株混樣作1次生物學重復，共3次重復。

1.3 試驗方法

1.3.1LEA3基因的克隆 ①總RNA提取與cDNA的合成。取1 g葉片置于液氮中研磨至粉狀，用酸酚-異硫氰酸胍-氯仿法提取葉片總RNA[20]。用1 %甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測提取葉片總RNA的質(zhì)量。以總RNA為模板，按照ReverAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 說明書操作步驟合成cDNA。②LEA3基因的克隆。參照已登錄大麥(Hordeumvulgare，F(xiàn)J026802.1)LEA3基因序列，設(shè)計2對特異性引物，引物序列見表1。引物P1和P2組合，預擴增片段長度382 bp，得到LEA3基因的上半段；引物P3和P4組合，預擴增片段長度406 bp，得到LEA3基因的下半段。PCR反應(yīng)體系20 μl：2×TaqPCR Master Mix 10 μl，上、下游引物各0.2 μl(10 μmol/L)，cDNA 1 μl(100 ng/μl)，ddH2O 8.6 μl。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。目的片段經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測并經(jīng)膠回收試劑盒回收，與pMD19-T載體16 ℃連接過夜，將構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，涂布含0.1 %的LB瓊脂平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑選單菌落，經(jīng)菌落PCR和質(zhì)粒PCR鑒定，各選取3個陽性克隆子測定核苷酸序列。

1.3.2LEA3基因序列分析 應(yīng)用DNAStar程序進行序列分析。通過NCBI的BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行核苷酸和蛋白質(zhì)序列相似性檢驗，利用ProtParam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)在線分析蛋白分子量、等電點、氨基酸組成，利用protscale(http://cn.expasy.org/tools/protscale.html)分析親水性/疏水性。利用TMHMM軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)。在線軟件SOPMA(http://npsa.pbil.ibcp.fr/)預測蛋白二級結(jié)構(gòu)。利用DNAMAN軟件進行同源性分析，以MEGA 7.0軟件Neighbor-Joining法分析系統(tǒng)進化樹。分析所用序列的來源分別為黔草1號和黔草2號葉片基因完整編碼區(qū)CDS序列，由貴州大學農(nóng)業(yè)生物工程研究院動物分子與基因工程實驗室克隆獲得并登錄到NCBI數(shù)據(jù)庫，小麥、大麥以及水稻等11個物種LEA3氨基酸序列均來源于NCBI數(shù)據(jù)庫(表2)。

1.3.3 基因表達分析 以不同干旱脅迫時間(0、1、2、3和4 d)葉片RNA為模板，進行不同品種高羊茅苗期持續(xù)干旱脅迫下基因的表達分析。按照ReverAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 說明書操作步驟合成cDNA。以qLEAU和qLEAD為引物，利用RealMasterMix(SYBR Green)試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]進行熒光定量PCR檢測(ABI 7500PCR儀)，3次重復。反應(yīng)條件為95 ℃預變性60 s；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。以qGADPHU和qGADPHD為引物擴增GADPH基因作為內(nèi)參，利用2-ΔΔCt計算基因相對表達量。試驗共進行3次生物學重復，每次重復包含3次技術(shù)重復。基因相對表達量數(shù)值采用Mean±Standard deviation 表示，經(jīng)Students’ t-test 檢驗在P<0.05 水平時認為在統(tǒng)計學上差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 2個高羊茅品種LEA3基因克隆與測序

2.1.1LEA3基因序列 通過總RNA反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增，黔草1號和黔草2號LEA3基因上半段擴增均獲得360 bp左右大小的片段，LEA3基因下半段擴增均獲得400 bp左右大小的DNA片段。與預期片段大小相近，條帶清晰(圖1)。測序結(jié)果表明，黔草1號LEA3基因上半段為361 bp，下半段為377 bp；黔草2號LEA3基因上半段為394 bp，下半段為410 bp。去除重疊部分，拼接后黔草1號獲得609 bp片段，黔草2號獲得642 bp。與已知序列相比，2個品種的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫公布的大麥(AKC92683.1)的LEA3基因序列相似性最高，黔草1號和黔草2號分別為87.60 %和85.4 %，2個樣品的擴增序列為LEA3基因。其中，黔草1號LEA3基因完整的ORF框長度為609 bp，共編碼202個氨基酸；黔草2號LEA3基因完整的ORF框長度為642 bp，共編碼213個氨基酸。

表1 引物序列

表2 LEA3序列登錄號

M為DL2000 DNA Marker；泳道1、2分別為黔草1號及黔草2號 LEA3基因上半段；泳道3、4分別為黔草1號及黔草2號 LEA3基因下半段

2.1.2LEA3基因序列比對 將黔草1號、黔草2號LEA3基因編碼氨基酸序列與擬南芥等植物的相應(yīng)序列比較發(fā)現(xiàn)，黔草1號、黔草2號LEA3基因編碼氨基酸序列均存在多個11個氨基酸組成的基元序列(TAQAAKEKAGE)，符合第三組LEA蛋白的典型結(jié)構(gòu)特征[21-22]。其中，黔草2號LEA3基因編碼氨基酸序列共包含8個基元序列；黔草1號包含7個基元序列(圖2)，較黔草2號缺失1個基元序列(11個氨基酸)。另外，從黔草1號和黔草2號LEA3基因編碼的氨基酸序列中，發(fā)現(xiàn)12個位點的氨基酸發(fā)生改變。

2.2 2個高羊茅品種LEA3蛋白的氨基酸組成及理化性質(zhì)

2.2.1 LEA3蛋白的氨基酸組成 從表3看出，黔草1號和黔草2號 LEA3蛋白均含丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸和蘇氨酸等親水性氨基酸，且不含半胱氨酸、脯氨酸和色氨酸，與INGRAM等[21]研究結(jié)果一致。進一步分析發(fā)現(xiàn)，異亮氨酸僅在黔草2號中存在，而苯丙氨酸僅在黔草1號中存在。

2.2.2 LEA3蛋白的理化性質(zhì) 黔草1號LEA3基因編碼蛋白的分子量為20.72 kDa，等電點8.55，總平均親水性為-0.971；黔草2號LEA3基因編碼蛋白分子量為22.01 kDa，等電點8.99，總平均親水性為-1.069(圖3)。2個品種 LEA3蛋白均有很強的親水性，且呈一定周期性，形成多個親水性高峰。總體看，黔草2號 LEA3蛋白親水性大于黔草1號。2個品種LEA3蛋白均不包含跨膜區(qū)域，屬于非跨膜蛋白。黔草1號 LEA3由73.76 % α-螺旋、19.31 %無規(guī)卷曲、3.96 %延伸鏈和2.97 % β-折疊構(gòu)成；黔草2號 LEA3由77.46 % α-螺旋、14.55 %無規(guī)卷曲、4.23 %延伸鏈和3.76 % β-折疊構(gòu)成(圖4)。

下劃線代表11個氨基酸的基元序列，---代表黔草1號缺失11個氨基酸的基元序列，方框代表突變的氨基酸，*表示終止密碼子

表3 黔草1號和黔草2號 LEA3蛋白氨基酸組成及其含量

圖3 黔草1號和黔草2號 LEA3 蛋白的親水性/疏水性分析

長豎線為α-螺旋結(jié)構(gòu)，短豎線為無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)

2.3 2個高羊茅品種LEA3基因序列的同源性及進化樹

2.3.1 同源性比較 13個物種的LEA3氨基酸序列多重序列比較(圖5)發(fā)現(xiàn)，黔草1號和黔草2號 LEA3相似度達93.6 %，兩者與大麥HvLEA(相似度87.60 %、85.40 %)、山羊草AtLEA3(相似度86.5 %、86.7 %)、冰草AcLEA3-1(相似度84.7 %、84.6 %)和小麥TaLEA3(相似度81.70 %、81.70 %)的相似度最高，其次是水稻OsLEA3(相似度59.9 %、58.9 %)、貴州懸竹AcLEA3(相似度均為64.80 %)，而與小米SiLEA3(相似度56.40 %、54.90 %)和玉米ZmLEA3(相似度52.8 %、52.80 %)同源性較低。

2.3.2 進化樹 以擬南芥LEA3氨基酸(AtLEA3-2)序列為外群，將黔草1號、黔草2號與其他10個物種的LEA3氨基酸序列進行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)。黔草1號和黔草2號的LEA3蛋白與小麥、旱麥草、大麥、山羊草、無芒雀麥、冰草聚為一類；貴州懸竹、玉米、小米聚為一類；水稻單獨為一類，說明黔草1號和黔草2號 LEA3蛋白與小麥的遺傳距離最近。

2.4 2個高羊茅品種LEA3基因苗期干旱脅迫的表達

以管家基因GADPH作為內(nèi)參，利用2-ΔΔCt計算不同干旱處理下黔草1號和黔草2號LEA3基因相對表達量(表4)。經(jīng)干旱脅迫處理后，黔草1號和黔草2號LEA3基因表達量均隨著處理時間的延長呈先升后降的趨勢。-2.5 MPa PEG 6000處理黔草1號LEA3基因的表達量在第2天達最高峰，為0 d的80倍左右(P<0.01)；黔草2號LEA3基因表達量在脅迫處理第1天達最高峰，為0 d的26倍左右(P<0.01)。-1.5 MPa PEG 6000處理下，黔草1號和黔草2號LEA3表達趨勢與-2.5 MPa PEG 6000處理的相同，黔草1號和黔草2號LEA3基因分別在脅迫處理第2天和第1天表達量達最高峰，分別為0 d的60和20倍左右(P<0.01)。黔草1號LEA3基因的表達量在整個脅迫過程中總體高于黔草2號，且2個品種高羊茅在-2.5 MPa PEG 6000下的LEA3基因的表達量較-1.5 MPa PEG 6000脅迫高。

圖5 LEA3氨基酸同源性比較

圖6 LEA3蛋白的系統(tǒng)進化樹

3 討 論

LEA蛋白是一類與逆境相關(guān)的蛋白質(zhì)，目前LEA2基因(脫水素基因，Dhn)與LEA3基因是研究最多的2類抗旱基因。已有研究證實LEA3蛋白的積累程度與植物抗旱性呈正相關(guān)[23]。LEA3主要存在于植物細胞的細胞質(zhì)中，且LEA3對植物組織的脫水性保護在于其多拷貝基元重復序列(即11個氨基酸形成的基元序列)形成的具有高度親水性的兼性α-螺旋結(jié)構(gòu)。雖然目前尚無研究表明基元序列的拷貝數(shù)與抗旱性強弱之間存在關(guān)系[24-25]，但在對不同品種的青稞品系與LEA3蛋白保守基元拷貝數(shù)之間進行研究時發(fā)現(xiàn)，同一作物品種中LEA3蛋白基因也具有多態(tài)現(xiàn)象，表現(xiàn)在抗旱性強的品種冬青8號的LEA3蛋白缺失第4個保守基元序列，但同時除LEA3蛋白的保守基元序列拷貝數(shù)存在差異外，編碼框內(nèi)還存在6個氨基酸親水性的改變[26]。研究對比黔草1號和黔草2號高羊茅品種的LEA3基因編碼氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，黔草1號、黔草2號LEA3基因編碼氨基酸序列也存在LEA3蛋白基因多態(tài)現(xiàn)象，即黔草1號 LEA3蛋白比黔草2號缺失1個基元序列，且在黔草1號、黔草2號LEA3基因編碼的氨基酸序列存在12個位點的氨基酸差異，這些差異使LEA3蛋白的親水性發(fā)生變化，表現(xiàn)為LEA3蛋白親水性黔草2號高于黔草1號，但LEA3蛋白保守序列基元拷貝數(shù)差異與植物抗旱性強弱之間的關(guān)系，還需要進一步研究。

表4 不同干旱處理黔草1號和黔草2號 LEA3基因的表達量

4 結(jié) 論

通過克隆測序獲得高羊茅品種黔草1號和黔草2號LEA3基因完整的ORF框，長度分別為609 bp和642 bp，分別編碼203個氨基酸和213個氨基酸。比較2個高羊茅品種LEA3蛋白發(fā)現(xiàn)，黔草1號 LEA3蛋白比黔草2號缺失1個包含11個氨基酸的基元序列，且兩者的氨基酸序列存在12個位點差異，而這些差異使得2個高羊茅品種LEA3蛋白在分子質(zhì)量、等電點、親水性上存在差異，黔草2號 LEA3的親水性強于黔草1號。對不同干旱處理黔草1號和黔草2號LEA3基因表達模式分析發(fā)現(xiàn)，高羊茅品種的抗旱性與其LEA3基因的表達量呈正相關(guān)，2個高羊茅品種LEA3基因表達量均隨干旱脅迫處理時間的延長呈先升后降趨勢，黔草1號LEA3基因表達量在整個脅迫過程中總體高于黔草2號，由此推測，在受到干旱脅迫時，黔草1號更能適應(yīng)干旱環(huán)境。