基于鹽脅迫的苦豆子種子生理特性和賴氨酸脫羧酶基因表達分析

周玉梅，洪園淑，李文娟，劉 萍*，田 蕾

(1.寧夏優勢特色作物現代分子育種重點實驗室，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021)

【研究意義】苦豆子(SophaoraalopecuroidesL.)為豆科槐屬多年生草本根莖地下芽植物，又名苦甘草[1]。主要分布于我國西北部的干旱荒漠地區[2]。耐鹽堿、抗干旱，也是重要的防風固沙和改良鹽堿地的優選野生植物[3]?？喽棺泳哂星鍩峤舛?、抗菌消炎等作用，以氧化苦參堿(oxymatrine，OMA)和苦參堿(matrine，MA)為原料研發的藥劑主要用于治療慢性乙型病毒性肝炎和婦科霉菌性炎癥[4]?！厩叭搜芯窟M展】賴氨酸脫羧酶(Lysine decarboxylase，LDC)基因是OMA和MA生物合成的第一個關鍵酶基因[5]，可以催化賴氨酸脫羧生成尸胺(cadaverine, Cad)。楊毅等[6]在苦豆子中克隆獲得了SaLDC，在PEG脅迫下，SaLDC表達量與OMA含量呈正相關；陸姍姍等[7]通過步移法獲得SaLDC上游1260 bp的啟動子序列，生物信息學分析顯示，該啟動子序列中含有逆境應答相關的順式作用元件；劉丹等[8]和段啟榮等[9]用PEG模擬干旱條件脅迫苦豆子種子和幼苗，研究表明適度干旱有助于苦豆子種子的萌發，萌動種子對干旱有較強的防御機制，苦豆子幼苗對干旱脅迫也具有較強的適應能力；苗永美等[10]利用RT-PCR技術從耐冷黃瓜品種中克隆獲得了CsLDC，通過qRT-PCR證明該基因受低溫和鹽脅迫的誘導而表達；張吉順等[11]采用同源克隆和RT-PCR技術在煙草中克隆獲得NtLDC1，qPCR表明低溫可以誘導NtLDC1的表達。Bunsupa等[5]將羽扇豆的La-L/ODC轉入模式植物擬南芥和煙草后發現其Cad含量增加；Kuznetsov等[12]將冰葉日中花用不同濃度的NaCl溶液處理后發現葉片中LDC活性提高,且Cad含量增加。目前，對鹽脅迫條件下苦豆子耐鹽相關的生理特性變化研究很少，SaLDC對鹽脅迫的響應機制更是鮮有報道?！颈狙芯壳腥朦c】本研究利用NaCl模擬鹽害環境，探索苦豆子種子在鹽害條件下，種子萌發時的耐鹽閾值和耐鹽相關的生理特性、SaLDC的基因表達以及與直接產物Cad含量的變化,旨在揭示苦豆子種子萌發過程中對鹽脅迫響應的生理特性變化規律、SaLDC的表達與Cad含量之間的關系?！緮M解決的關鍵問題】本研究結果為進一步研究苦豆子的耐鹽機制和SaLDC的生物學功能奠定基礎，也為人工植播栽培苦豆子提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

苦豆子莢果采自寧夏永寧縣楊和鄉(東經106.144°，北緯38.138°)，由寧夏大學農學院李小偉副教授鑒定。室內自然干燥后脫粒，精選飽滿的種子，用98 % H2SO4處理以破除硬實，清水反復沖洗晾干后備用。

1.2 種子萌發

用濃度為100、200、300 mmol·L-1的NaCl溶液模擬鹽脅迫，以蒸餾水為對照脅迫苦豆子種子，脅迫時間為7 d，每個試驗設置3次重復。各處理隨機取55粒種子于鋪有2層濾紙的培養皿(φ = 15 cm)內，加入10 mL相應的脅迫溶液25 ℃恒溫培養，每12 h更換脅迫溶液1次。種子發芽指標測定參照《種子學》[13]包括發芽勢、發芽率、鮮重和胚根長。分別計算發芽指數(GI)、活力指數(VI)、簡化活力指數(SVI)和相對鹽害率。脅迫結束后迅速剝取子葉測定相對質膜透性，剩余的子葉、下胚軸和胚根，一部分105 ℃殺青30 min后，85 ℃恒溫烘干，粉碎后過60目篩用于檢測Cad含量，另一部分液氮速凍后-80 ℃保存，進行相應生理指標測定和SaLDC的qPCR分析。

GI=Σ(Gt/Dt)

式中，Gt表示第t天的發芽數，Dt表示相應的發芽天數。

VI=S×GI

式中，S為第7天胚根長總和的平均值，GI為發芽指數。

SVI=G×S

式中，G為發芽率，S為第7天胚根長總和的平均值[14]。

相對鹽害率(%)=(對照發芽率-鹽處理發芽率)/對照發芽率×100[15]。

1.3 生理活性測定方法

質膜相對透性(plasma membrane permeability,PMP)采用電解質外滲量法[16]，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[16]，脯氨酸(Pro)含量采用茚三酮顯色法[16]，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑法[16]；過氧化物酶(POD)活性采用愈創木酚法[17]；過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法[16]。每個指標重復測定3次。

1.4 尸胺提取和含量測定

尸胺提取和衍生化：準確稱取苦豆子粉末0.10 g，加入0.4 mol·L-1高氯酸2.0 mL，黑暗靜置15 h，超聲10 min，10 000 r/min離心10 min。吸取上清液0.5 mL，加0.9 mL飽和碳酸鈉溶液和0.5 mL·10 g·L-1丹磺酰氯(Sigma公司)，渦旋混勻，于40 ℃避光振搖1 h后，加100 μl氨水終止反應，用1.0 mL乙腈(色譜純,Fisher 公司)萃取目標物，6000 r/min離心5 min，上層液過0.22 μm濾膜后得到待測樣品。

Agilent 1220 Infinity Ⅱ LC 高效液相色譜儀進行尸胺含量的測定。色譜條件：參考王燕華等[18]方法并稍加修改，色譜柱ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，紫外檢測波長254 nm，柱溫30 ℃，進樣量50 μl，流動相乙腈∶水(0.7∶0.3)，流速為1.0 mL/min。

標準曲線的制備：準確稱取尸胺二鹽酸鹽(Sigma公司)5.55 mg，以0.1 mol/L鹽酸溶解并定容。衍生、進樣，標準工作溶液進樣量0.1、0.3、0.5、1.0、3.0、5.0 μl為橫坐標，以相應的峰面積為縱坐標，得到尸胺的線性回歸方程及其線性相關系數：Y=557.62X+1.9462，R2=1.0000；用標準工作曲線計算樣品尸胺含量。

表1 NaCl脅迫對苦豆子種子萌發的影響

1.5 總RNA提取、cDNA第一鏈合成和qRT-PCR

取-80 ℃保存的苦豆子樣品按試劑盒(TRlzol Invitrogen，北京天根生化科技有限公司)說明提取RNA，1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測質量合格后，按照試劑盒說明書(PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，TaKaRa)反轉錄合成cDNA第一鏈。根據已獲得SaLDC的序列，參照楊毅等[6]設計的引物，在AnalyticyenaqTOWER3G熒光定量PCR儀上進行qRT-PCR，反應采用20 μl體系：2×UltraSYBR Mixture 10 μl，Forward Primer(10 μM) 1 μl，Reverse Primer(10 μM) 1 μl，Template cDNA1 μl，ddH2O 7 μl。擴增程序：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40個循環。按照2-△△CT法計算基因的相對表達量[19]。

1.6 數據處理

采用Microsoft Excel 2016進行數據處理并作圖，利用SPSS 23.0軟件對數據進行方差分析和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫對苦豆子種子萌發的影響

由表1顯示，隨NaCl濃度的增加，苦豆子種子發芽勢、發芽率、發芽指數、活力指數、簡化活力指數、胚根長和鮮重均呈降低趨勢，相對鹽害率上升(表1)，各處理間差異顯著。當NaCl濃度為200 mmol·L-1時，種子的各項活力指標與對照相比極顯著下降，發芽勢和發芽率分別為2.42 %和63.64 %，相對鹽害率為32.59 %；當NaCl濃度升至300 mmol·L-1時，各項指標進一步下降，相對鹽害率上升至75.59 %?？梢姛o論是苦豆子的各項活力指標、還是鹽害率，都表現出隨著NaCl濃度升高，種子萌發受到的影響越大，200 mmol·L-1的NaCl濃度可以被確定為苦豆子種子萌發時的耐鹽閾值。

2.2 NaCl脅迫對苦豆子種子耐鹽生理特性的影響

由表2顯示，苦豆子種子在NaCl溶液脅迫下，PMP、Pro和MDA含量、POD、SOD和CAT酶活性均發生相應的變化。隨NaCl濃度的增加，萌發種子子葉中PMP、Pro含量和CAT酶活性表現為上升，MDA含量、POD和SOD酶活性表現為下降。分析發現輕度鹽脅迫(NaCl溶液≤100 mmol·L-1)就足以引起Pro含量、POD和CAT酶活性的顯著提高(P<0.05)，尤其是POD酶活性驟然升高至CK的3.9倍，表明苦豆子種子對鹽脅迫反應靈敏，低濃度的鹽溶液就足以引起其自身保護性物質Pro含量的極顯著增加和保護酶POD與CAT活性的極顯著或顯著上升，有效保護細胞膜不受傷害以減少鹽溶液對種子萌發的影響。中度鹽脅迫(100 mmol·L-1< NaCl溶液≤200 mmol·L-1)下，Pro和MDA含量及CAT酶活性與輕度鹽脅迫差異不顯著，但POD和SOD酶活性均顯著下降。重度鹽脅迫(NaCl溶液>200 mmol·L-1)下，PMP、Pro含量和CAT酶活性極顯著上升(P<0.01)，相反MDA含量、SOD和POD酶活性卻下降至最低，與CK相比差異極顯著。

2.3 苦豆子種子中賴氨酸脫羧酶基因(SaLDC)對NaCl脅迫的響應

qRT-PCR分析表明，無論是對照還是鹽脅迫7 d的苦豆子種子，SaLDC在種子各組織中均有表達，且以子葉中表達量最高，下胚軸中表達量最低；由圖1可見，鹽脅迫有助于在種子萌發過程誘導各組織中SaLDC的表達。經輕、中度鹽脅迫后，子葉中SaLDC表達量和CK差異不顯著，但重度鹽脅迫后SaLDC表達量驟然上升，是CK的19.8倍；下胚軸是種子中SaLDC表達量最低的組織，但它對鹽脅迫表現最為敏感，100～200 mmol·L-1的輕中度的鹽脅迫即可引起表達量上調，重度鹽脅迫后其表達量下調，是中度脅迫的37.17 %，但依然高于CK；胚根對低鹽脅迫不敏感，其SaLDC表達量與CK基本相同，但重度鹽脅迫時表達量迅速上調，是對照的2.9倍。

表2 NaCl脅迫對苦豆子種子耐鹽生理特性的影響

圖柱上不同大小寫字母表示在0.01和0.05水平差異顯著

2.4 NaCl脅迫后苦豆子種子中尸胺含量的變化

經HPLC檢測發現，無論是NaCl脅迫還是未經NaCl脅迫的苦豆子種子子葉中均無Cad存在，Cad只存在于下胚軸和胚根中，且隨脅迫濃度的增加Cad含量極顯著下降，此外，分析發現除重度脅迫外，胚根中Cad含量均高于下胚軸，在300 mmol·L-1NaCl重度脅迫下，胚根中Cad含量為0(表3)。

3 討 論

鹽脅迫對種子萌發的影響程度與鹽分的種類、濃度及植物自身的耐鹽能力有關[20]。本研究表明,不同濃度NaCl溶液對苦豆子種子萌發均有抑制作用，隨NaCl溶液濃度的增加，種子萌發的各項指標、胚根長、鮮重均降低,相對鹽害率呈上升趨勢；當鹽濃度達到300 mmol·L-1時，種子的發芽率僅為23.03 %，遠低于種子正常發芽率50 %的閾值，因此，200 mmol·L-1NaCl濃度可以看作是維持苦豆子種子正常萌發的耐鹽閾值。

植物在逆境條件下，體內Pro等滲透性調節物的積累能夠有效減緩NaCl脅迫對其造成的傷害[21]，

表3 NaCl脅迫下苦豆子種子不同組織中Cad含量的變化

SOD、POD和CAT抗氧化酶能有效消除活性氧自由基，防止細胞膜被氧化破壞[22]，在植物抗逆生理中有重要作用。劉丹等[8]用PEG模擬干旱條件脅迫苦豆子種子，發現在輕度脅迫(PEG≤20 %)時POD酶起主要作用，重度脅迫(PEG>20 %)時CAT和SOD酶起主要作用；周麗等[23]對銀柴胡葉片SOD、POD和CAT酶活性研究后認為這3種酶均隨著NaCl脅迫程度的增加，酶活性先升高后降低。本研究發現苦豆子種子在受到輕度鹽脅迫時，子葉中Pro含量、CAT和POD保護酶活性顯著或極顯著高于CK，是此時抵御鹽脅迫的主要保護性物質，能維持細胞內基本正常的滲透壓，以降低NaCl脅迫對自身的傷害，中度脅迫下，POD和CAT的酶活性還能保持在較高水平，然而在重度鹽脅迫下子葉中POD和SOD酶活性已降至最低值，只有 CAT酶還保持比較高的活性，成為抵抗高鹽的主要保護酶，但此時高濃度鹽溶液的脅迫壓力已超過了各滲透調節物質和保護酶系統的調節范圍，質膜透性和部分保護酶系統遭到破壞，導致種子在萌發過程中受到嚴重傷害，因而相對鹽害率極顯著上升。由此進一步說明對苦豆子而言，能使種子在萌發期耐受NaCl溶液脅迫、正常萌發的耐鹽閾值應為200 mmol·L-1。當植株受到外界逆境條件脅迫時，植株體內會產生某些特異表達的基因[24]。楊毅等[25]研究發現苦豆子幼苗葉片SaLDC表達受干旱脅迫的調控，尤其在重度脅迫下表達上調。本研究發現苦豆子種子無論是未經鹽脅迫還是經鹽脅迫后，SaLDC在種子各組織中的表達均有差異，表明苦豆子種子各組織中SaLDC參與了對鹽脅迫的響應且存在組織表達特異性。Aziz等[26]對油菜進行PEG滲透脅迫后發現葉片中Cad含量增加；Kuznetsov等[12]研究發現冰葉日中花在受到NaCl處理時，葉片內Cad含量也增加。本研究發現苦豆子子葉中沒有Cad，但在下胚軸和胚根中檢測到高濃度的Cad，此結果與Scoccianti等[27]對大豆種子的研究結果相一致。Villanueva等[28]發現種子萌發和幼苗生長過程中，多胺生物合成主要發生在胚軸中，Lin等[29]發現在大豆種子萌發過程中下胚軸和胚根在生長早期合成和積累了大量的Cad和腐胺(Putrescine，Put)，其合成的大多數氨基酸前體是由子葉蛋白分解提供的。本研究NaCl脅迫使下胚軸和胚根中Cad含量下降，可能與NaCl脅迫促使種子在萌發過程中加速消耗部分Cad以減少對其生長的影響有關，其原因還有待進一步研究。

4 結 論

苦豆子種子能耐受一定濃度的NaCl溶液脅迫，保證種子在NaCl溶液中正常萌發的閾值是200 mmol·L-1；SaLDC具有組織表達特異性，鹽脅迫有助于誘導該基因的表達；子葉中未檢測到Cad，下胚軸和胚根中Cad含量隨NaCl濃度增加而下降。