蕓苔素類物質生物學活性比較研究與評價

王強鋒，李 芹，夏中梅，陳 春，鄧自圓，林 楊，侯 勇，王海濤

(四川省農業科學院生物技術核技術研究所，四川 成都 610066)

【研究意義】蕓苔素甾醇類(Brassinosteroids，BRs)部分化合物具有促進植物細胞伸長、細胞分裂、生殖發育、光形態建成，增強植物抗逆性的生物活性[1]。具體有以下幾方面的生理效應：①調節維管組織分化，促進莖部生長，促進葉片發育，增強光合效率；②促進側根和根毛的發育；③可提高植物雄性器官育性，促進種子灌漿和果實成熟，促進種子萌發；④調節植物體內氧化代謝，提高植物對水分、溫度、鹽分、重金屬等多種非生物脅迫的適應性[2-4]；⑤促進植物對礦質養分的吸收，提高植物營養物質利用效率[5]。因此，蕓苔素甾醇參與調節植物生長多個生理過程，對植物生長發育具有重要作用。自1970年Mitchell等從油菜花粉中提取的高活性生理物質被Grove等鑒定為蕓苔素內酯(Brassinolide，BL)后[6-7]，隨著植物提取分離技術的改進和實驗手段的提高，人們又陸續發現了24-表蕓苔素內酯(24-epibrassinolide，EBL)、28-高蕓苔素內酯(28-homobrassinolide，HBL)、蕓苔素甾酮(Brassinosterone，BRO)、28-脫甲基蕓苔素內酯(28-norbrassinolide，NBL)等在植物體內廣泛存在的天然蕓苔素活性物質，至今已發現植物體內存在67種天然蕓苔素類物質和15種合成前體物質[8-10]。蕓苔素類物質的生物活性與其分子構型、手性中心、官能團構象與取代位置有直接關系，在已知的這些結構中蕓苔素內酯、24-表蕓苔素內酯、28-高蕓苔素內酯、蕓苔素甾酮等對植物具有較高的生長調節活性[11]。目前，采用仿生化學制備技術可獲得蕓苔素類物質130余種，其生物學活性差異主要來源于側鏈C-24取代基的類型和C-22、C-23羥基的數目、構型[12-13]。在2016年以前，國內把這一類蕓苔素活性物質統稱為蕓苔素內酯，并在農業部登記。因蕓苔素類物質不同結構存在較大的活性差異，2016年國家工業和信息化部發布了蕓苔素類物質相關應用制劑行業標準，對不同結構的蕓苔素進行了明確區分，與國際上對這類物質的結構與命名保持一致。目前，在我國農業部登記注冊，允許大田推廣應用的蕓苔素活性物質主要有24-表蕓苔素內酯、28-高蕓苔素內酯、28-表高蕓苔素內酯(28-epihomobrassinolide，EHBL)、22,23,24-三表蕓苔素內酯(22,23,24-triepibrassinolide，TRBL)、14-羥基蕓苔素甾醇(14-hydroxylated brassinosteroid，HOBR)等，對這些蕓苔素類物質有關生物活性系統地比較研究，有利于精準用藥，提高農業投入品利用效率，減少環境負擔。【前人研究進展】目前，用于植物生理活性物質室內生物學活性鑒定方法主要有菜豆第二節間伸長法(Bean Second Internode，BSI)、水稻葉片傾斜法(Rice Lamina Inclination，RLI)、小麥葉片展開法(Wheat Leaf-unrolling，WLU)、蘿卜幼苗伸長法(Radish Seedling Elongation，RSE)、番茄下胚軸伸長法(Tomato Hypocotyl Elongation，THE)等方法，不同活性物質對同一生物材料敏感度不一樣，生物學響應差異也比較明顯[14-15]。關于蕓苔素類物質的生物活性鑒定，國內外學者通常選擇菜豆第二節間伸長法或者水稻葉片傾斜法，已有的研究報道多為單一的方法對單一的某種蕓苔素結構進行活性鑒定，還沒有采用多種方法對多個蕓苔素活性物質進行系統全面的生物活性評價方面的研究報道，尤其是我國目前有多個蕓苔素活性物質在大田推廣應用的情況下，開展對這些物質的生物學活性系統地評價與比較研究對生產實踐具有較好的指導作用。【本研究切入點】采用不同的生物活性鑒定方法，系統地比較研究不同蕓苔素類物質的生物活性，更客觀地判斷不同結構蕓苔素類物質的生物響應效果。高活性的蕓苔素類物質在農業生產上具有重要的應用前景，但如何使用、何時使用、使用劑量都還有待進一步探討。【擬解決的關鍵問題】比較我國目前允許生產上使用的不同結構蕓苔素類物質的生物活性，進一步探討有利于作物生長的施用方式和施用濃度，為蕓苔素類物質服務于農業生產提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植物：水稻、綠豆、小麥(西農529)、芹菜(泰國四季白芹)、大豆(中黃37)。

供試藥劑：24-表蕓苔素內酯(EBL，純度95.20 %)，28-高蕓苔素內酯(HBL，純度92.04 %)，28-表高蕓苔素內酯(EHBL，純度86.13 %)，22,23,24-三表蕓苔素內酯(TRBL，純度90.44 %)，由四川省蘭月科技有限公司提供。14-羥基蕓苔素甾醇(HOBR，0.01 %水劑)，購自成都新朝陽作物科學股份有限公司。

1.2 試驗設計與處理

1.2.1 水稻第二葉片傾斜法鑒定蕓苔素類物質活性 5種蕓苔素類物質分別設20、40 μg·L-12個濃度處理，以清水為對照，共11個處理，每個處理重復3次，完全隨機排列。

水稻種子經10 %的H2O2消毒30 min后，均勻播撒在潤濕的濾紙上，在恒溫恒濕箱中(溫度35 ℃、濕度60 %)催芽，保持黑暗條件。出苗8～9 d后，選取長勢一致的幼苗以第二葉葉枕為中心，剪取約2 cm的切段，于30 ℃黑暗條件下清水中浸泡24 h。將上述5種蕓苔素類物質配制成相應濃度的溶液置于培養皿中，各浸泡20個切段，30 ℃黑暗條件下浸泡48h后測量葉片傾斜角度。

1.2.2 綠豆上胚軸伸長法鑒定蕓苔素類物質活性 5種蕓苔素類物質分別設20、40 μg·L-12個濃度處理，以清水為對照，共11個處理，每個處理重復3次，完全隨機排列。

綠豆種子經表面消毒后，置于TW-003型自動發芽機中催芽。待綠豆上胚軸生長至3 cm左右，選擇長勢一致(上胚軸長度相近)的幼苗剪取含頂芽、初生葉、上胚軸和下胚軸(3 cm)的插條。將上述5種蕓苔素類物質配制成相應濃度的溶液置于塑料杯中，各放入8個插條培養48 h后測量上胚軸伸長量。

1.2.3 小麥葉片展開法鑒定蕓苔素類物質活性 5種蕓苔素類物質分別設5、20 μg·L-12個濃度處理，以清水為對照，共11個處理，每個處理重復3次，完全隨機排列。

小麥種子經表面消毒后，置于TW-003型自動發芽機中催芽，保持黑暗。待小麥幼苗生長至7～8 cm，選擇長勢一致的幼苗去除葉片1.5 cm長的尖端，再剪下1 cm左右卷筒狀幼葉。將上述5種蕓苔素類物質配制成相應濃度的溶液置于塑料杯中，各放入15～20個切段黑暗條件下浸泡24 h，解剖鏡下觀察并測量葉片展開寬度。

1.2.4 蕓苔素類物質不同施用方式對芹菜和大豆生長的影響 試驗采用葉面噴施和灌根的方法，將0、1、5、10 μg·L-124-表蕓苔素內酯 4個濃度處理施于芹菜，將0、0.05、0. 1、0.5、1 μg·L-124-表蕓苔素內酯5個濃度處理施于大豆，每處理重復7次。

芹菜和大豆種子用咪鮮胺表面消毒，分別均勻播撒在鋪有潤濕濾紙的培養皿和育苗盤中催芽，出苗后用海綿固定，兩葉一心時選擇長勢一致的幼苗移栽至均勻打孔的PVC管(內徑7.0 cm，長100 cm) 中，每管7孔，每孔1株。采用華南農業大學葉菜營養液配方B培養，期間采用自然光照，并補充適量蒸餾水。待四葉一心時進行葉面噴施和灌根處理，處理前更換營養液，將相應濃度的24-表蕓苔素內酯添加在營養液中充分混勻后進行灌根處理。7 d更換1次營養液，并進行第2次處理，整個生育期共處理2次。

芹菜于處理后30 d采樣，大豆于成熟期采樣，以單株為1次重復，每處理采集7個重復。樣品經水沖洗擦干后，分為地下部和地上部。采用直尺測量法測定植株株高和根長，采用稱量法分別測定地下部和地上部生物量，以鮮重計。其中大豆株高用莖部子葉痕到頂莢的距離表示。

1.3 數據處理與分析

采用DPS 11.0進行統計分析，LSD法進行多重比較(P<0.05)；Origin 9.0和Excel 2013進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 不同蕓苔素類物質生物活性的差異

2.1.1 水稻第二葉片傾斜法 蕓苔素類物質促進水稻葉片偏離莖部，形成一定角度(圖1-A)，各傾斜角度的葉片相對數目可反映不同結構蕓苔素類物質的活性差異(圖1-B)。圖1-B中，水稻葉片傾斜角度越大θ，條形圖顏色越深，相應傾斜角度的葉片相對數目越多，蕓苔素類物質生物活性越高。由圖1可知，隨蕓苔素類物質處理濃度升高，水稻葉片傾斜角度越大，大角度葉片的相對數目增多。清水處理下12.2 %的水稻傾斜角度大于50°，各蕓苔素類物質處理下15.2 %～89.3 %的葉片傾斜角度達50° 以上。可知 24-表蕓苔素內酯、28-高蕓苔素內酯、28-表高蕓苔素內酯、22,23,24-三表蕓苔素內酯和14-羥基蕓苔素甾醇均促進水稻第二葉片傾斜。20 μg·L-1處理下，24-表蕓苔素內酯和28-高蕓苔素內酯促進水稻葉片傾斜150～180°；40 μg·L-1處理下，24-表蕓苔素內酯、28-高蕓苔素內酯、28-表高蕓苔素內酯和14-羥基蕓苔素甾醇處理分別有22.9 %、35.7 %、5.9 % 和4.8 % 的葉片傾斜角度大于150°，22,23,24-三表蕓苔素內酯處理未見葉片傾斜達150°。基于此，各蕓苔素類物質促進水稻第二葉片傾斜的活性順序為：28-高蕓苔素內酯>24-表蕓苔素內酯>28-表高蕓苔素內酯>14-羥基蕓苔素甾醇>22,23,24-三表蕓苔素內酯。

2.1.2 綠豆上胚軸伸長法 由圖2可知，蕓苔素類物質可促進綠豆上胚軸伸長。除14-羥基蕓苔素甾醇外，綠豆上胚軸伸長量隨蕓苔素類物質濃度升高而增加。24-表蕓苔素內酯、28-高蕓苔素內酯、28-表高蕓苔素內酯和22,23,24-三表蕓苔素內酯處理下綠豆上胚軸伸長量顯著高于對照，是清水處理的1.19～1.75倍；14-羥基蕓苔素甾醇處理下綠豆上胚軸伸長量較小，是清水處理的81.2 %～68.8 %。不同濃度下，24-表蕓苔素內酯處理綠豆上胚軸伸長量最大，28-高蕓苔素內酯、28-表高蕓苔素內酯和22,23,24-三表蕓苔素內酯處理下綠豆上胚軸伸長量差異不顯著，14-羥基蕓苔素甾醇處理下伸長量最小。20 和40 μg·L-124-表蕓苔素內酯處理下，綠豆上胚軸伸長量分別是清水處理的1.56和1.75倍；而14-羥基蕓苔素甾醇相應濃度處理分別是是清水的81.2 %和68.8 %。可見，蕓苔素類物質促進綠豆上胚軸伸長的活性排序為：24-表蕓苔素內酯>28-高蕓苔素內酯、28-表高蕓苔素內酯、22,23,24-三表蕓苔素內酯>14-羥基蕓苔素甾醇。

圖中“EBL”表示24-表蕓苔素內酯，“HBL”表示28-高蕓苔素內酯，“EHBL”表示28-表高蕓苔素內酯，“TRBL”表示22,23,24-三表蕓苔素內酯，“HOBR”表示14-羥基蕓苔素甾醇。下同

圖中小寫字母表示處理間差異顯著(P < 0.05)。下同

2.1.3 小麥葉片展開法 由圖3-A可知，蕓苔素類物質促進小麥葉片展開，隨處理濃度升高，小麥葉片展開寬度越大。5種蕓苔素類物質處理下，小麥葉片展開寬度差異明顯，結合圖3-B可發現各蕓苔素類物質處理下小麥葉片展開寬度顯著高于清水處理，是清水處理的1.25～2.10倍。隨處理濃度升高， 24-表蕓苔素內酯和28-高蕓苔素內酯處理下小麥葉片展開寬度顯著增加，28-表高蕓苔素內酯、22,23,24-三表蕓苔素內酯和14-羥基蕓苔素甾醇處理濃度間差異不顯著。處理濃度為5 μg·L-1時，24-表蕓苔素內酯和28-高蕓苔素內酯處理小麥葉片展開寬度差異不顯著；28-表高蕓苔素內酯、22,23,24-三表蕓苔素內酯和14-羥基蕓苔素甾醇處理差異不顯著；24-表蕓苔素內酯和28-高蕓苔素內酯處理小麥葉片展開寬度均顯著高于其他3種蕓苔素類物質。處理濃度為20 μg·L-1時，24-表蕓苔素內酯和28-高蕓苔素內酯處理小麥葉片展開寬度顯著高于28-表高蕓苔素內酯、22,23,24-三表蕓苔素內酯和14-羥基蕓苔素甾醇處理；28-表高蕓苔素內酯與22,23,24-三表蕓苔素內酯處理下小麥葉片展開寬度均顯著高于14-羥基蕓苔素甾醇處理。綜上，5種蕓苔素類物質促進小麥葉片展開的活性的活性排序為：28-高蕓苔素內酯>24-表蕓苔素內酯>28-表高蕓苔素內酯、22,23,24-三表蕓苔素內酯>14-羥基蕓苔素甾醇。

圖3 蕓苔素類物質處理下小麥葉片展開實拍(A)和展開寬度統計(B)

圖4 葉面噴施和灌施24-表蕓苔素內酯處理下芹菜長勢

圖5 24-表蕓苔素內酯不同施用方式對芹菜株高(A)和根長(B)的影響

2.2 蕓苔素類物質不同施用方式對作物生長的影響

2.2.1 葉面噴施和灌施對芹菜生長的影響 從圖4，圖5-A，圖6可知，24-表蕓苔素內酯不同施用方式對芹菜的生長具有較大影響，芹菜長勢存在明顯差異。葉面噴施1～10 μg·L-124-表蕓苔素內酯有利于芹菜的生長，葉面噴施處理下芹菜長勢優于灌根處理，植株較高，葉色深綠，株型緊湊，灌根處理使用過高濃度對芹菜有一定抑制。與對照相比，葉面噴施24-表蕓苔素內酯葉面噴施有利于增加芹菜株高、提升植株地上部生物量。葉面噴施24-表蕓苔素內酯，芹菜株高顯著高于對照，是清水處理的1.03～1.19倍，地上部生物量達17.27～19.93 g株-1，10 μg·L-1處理下高出清水處理17.6 %。葉面噴施1～10 μg·L-124-表蕓苔素內酯處理下，芹菜株高、根長均顯著高于灌根處理。1～10 μg·L-1范圍內，芹菜根系的伸長對24-表蕓苔素內酯較為敏感，葉面噴施處理下芹菜根長和地下部生物量高于灌根處理。

圖6 24-表蕓苔素內酯不同施用方式對芹菜地上部(A)和地下部(B)生物量的影響

2.2.2 葉面噴施和灌施對大豆生長的影響 由圖7可知，葉面噴施和灌施0.05～1 μg·L-124-表蕓苔素內酯處理下大豆長勢良好，結合圖4芹菜的長勢可知較低濃度的24-表蕓苔素內酯有利于作物的生長，對作物生長的調節具有微量高效的特征。隨葉面噴施濃度的升高，大豆株高、地上部生物量顯著增加，低濃度灌施處理下大豆株高和生物量增加(圖8～9)。葉面噴施0.5、1 μg·L-12,4-表蕓苔素內酯大豆株高顯著增加，分別是清水處理的1.10、1.21倍；灌施0.05、0.1和0.5 μg·L-124-表蕓苔素內酯大豆株高顯著增加，分別是清水處理的1.21、1.20和1.15倍。葉面噴施1 μg·L-124-表蕓苔素內酯比灌施有利于大豆地上部增高，是灌施相同濃度24-表蕓苔素內酯的1.14倍。灌施0.05、0.1 μg·L-124-表蕓苔素內酯處理下，大豆株高、地上部生物量與葉面噴施1 μg·L-124-表蕓苔素內酯處理下差異不顯著，灌施較低濃度24-表蕓苔素內酯可有效促進大豆地上部的生長。0.05～1 μg·L-124-表蕓苔素內酯兩種施用方式處理對大豆根長無明顯影響，葉面噴施0.05～1 μg·L-1和灌施0.05～0.1 μg·L-1處理下大豆地下部生物量顯著提高，是清水處理的1.08～1.26倍。綜上所述，葉面噴施和灌施0.05～1 μg·L-124-表蕓苔素內酯均有利于大豆地上部的生長，灌施適宜濃度低于葉面噴施。

圖7 葉面噴施和灌施24-表蕓苔素內酯處理下大豆長勢

圖8 24-表蕓苔素內酯不同施用方式對大豆株高(A)和根長(B)的影響

圖9 24-表蕓苔素內酯不同施用方式對大豆地上部(A)和地下部(B)生物量的影響

3 討 論

3.1 蕓苔素類物質的生物學活性評價

蕓苔素類物質的生物學活性主要取決于其化學結構特征，包括取代基類型、手性構象、官能團種類等的差異，其生物活性會存在明顯的差異[16-17]。已有的研究表明，蕓苔素類物質側鏈C-22、C-23具有R構型的雙羥基、C-24取代基呈S構型具有較高的生物活性[11-12]。如蕓苔素內酯、24-表蕓苔素內酯、28-高蕓苔素內酯具有類似的活性結構或活性中心，是目前普遍認為生物活性最高的蕓苔素類物質[18]。植物對蕓苔素類物質的信號感應與傳遞存在獨特的機制，而某些人工合成的蕓苔素類物質在植物中并未發現有與之相同的天然蕓苔素結構，如28-表高蕓苔素內酯、22,23,24-三表蕓苔素內酯等，但依然表現了一定的生物學活性。因此，蕓苔素類物質的生物活性可能受植物種類、受體蛋白、競爭性抑制等因素的影響而不同[19]。本研究采用水稻、綠豆、小麥為供試材料，從多角度系統地鑒定了5種蕓苔素類物質的活性，比較不同蕓苔素類物質生物活性的差異。結果表明，水稻第二葉片傾斜法、綠豆上胚軸伸長法和小麥葉片展開法均可有效鑒定5種蕓苔素類物質的活性，不同結構的蕓苔素類物質生物活性具有較大差異。本研究中，24-表蕓苔素內酯和28-高蕓苔素內酯處理下水稻葉片傾斜角度、綠豆上胚軸伸長量、小麥葉片展開寬度均高于其他3種蕓苔素類物質，表現出較高的活性。蕓苔素類物質促進水稻葉鞘兩側生長速度不一致，導致葉片逐漸偏離莖部，傾斜角度能夠較好地反應蕓苔素類物質的活性[19-20]。在一定范圍內，水稻葉片傾斜角度與蕓苔素類物質濃度存在線性關系[21]。本研究中5種蕓苔素類物質處理下水稻葉片傾斜角度隨處理濃度升高而增大，28-高蕓苔素內酯和24-表蕓苔素內酯促進水稻葉片傾斜的活性較高。目前，這2種天然結構已經通過化學技術實現規模化生產，并在農業生產上得到廣泛應用，取得了顯著的調控效果。

3.2 蕓苔素類物質對植物根、葉生長的影響及施用方法

植物體內蕓苔素類物質的種類和含量取決于植物的組織特性，在植株各部位均可合成，并通過長距離運輸影響全株的生長[22-23]。用蕓苔素類物質處理綠豆(Mung bean)下胚軸可促進上胚軸的伸長[24]，蘸根可提高葉片酶活性和葉綠素，促進全株生物量增加[25]，葉面噴施適宜濃度蕓苔素類物質可促進水稻側根和根毛發育[26]。本研究綠豆上胚軸伸長法鑒定蕓苔素類物質生物活性也證實了蕓苔素類物質并非只是原位發生生理作用，因此，在農業生產中采用不同施用方式/施用于不同部位均可促進作物的生長。本研究中，葉面噴施和灌施24-表蕓苔素內酯均促進大豆株高和地上部生物量的提升。

在植株葉片中，蕓苔素類物質能同時促進光系統II反應中心的電子傳遞和Rubisco的羧化活性, 并調節氣孔發育，增加CO2的同化[27-28]。葉面噴施蕓苔素類物質可增加作物的葉綠素含量、光合速率以及碳水化合物含量，提高葉片凈光合速率，促進作物生長[29]。在植物根系中，蕓苔素類物質可調控根尖分生組織(root apical meristem，RAM)分化以及根的伸長過程，影響不定根發生、側根發育、根毛形成、根尖重力反應等[30]。植物根內蕓苔素類物質本身含量較低，加之植物根對蕓苔素類物質的反應比植株其他部位更為敏感，因此較低濃度蕓苔素類物質有利于調節植物根系發育[31-32]。較低濃度的蕓苔素類物質可促進根系分生區細胞伸長和側根原基生長速率加快，進而增加根系長度和數目[33-34]。本研究對芹菜使用1～10 μg·L-124-表蕓苔素內酯處理，對大豆使用0.05～1 μg·L-124-表蕓苔素內酯處理，大豆根系發育較優，根長和生物量增加。可知，蕓苔素類物質適宜使用濃度一方面與作物本身的敏感性有關，另一方面蕓苔素類物質微量高效，對植物根系的生長存在劑量效應[26,35]。結合芹菜和大豆地下部的長度和生物量來看，較低濃度(≤ 0.1 μg·L-1)的24-表蕓苔素內酯促進作物根系的生長，同時可顯著提升作物的株高和地上部生物量。總體來說，葉面噴施和灌根蕓苔素類物質在農業生產中均可促進作物生長，但灌根使用濃度較葉面噴施更低。不同蕓苔素類物質活性差異較大，因此，農業生產中應用蕓苔素類物質應根據其活性和施用方式綜合考慮使用濃度。

4 結 論

3種生測方法均有效鑒定不同蕓苔素類物質的生物活性，24-表蕓苔素內酯和28-高蕓苔素內酯生物活性較高。葉面噴施和灌根24-表蕓苔素內酯有利于作物的生長，灌根處理適宜濃度低于葉面噴施。不同結構蕓苔素類物質活性差異較大，農業生產中蕓苔素類物質使用濃度應根據活性和施用方式綜合考慮。