中藥提取物對小鼠維生素A急性中毒中晚期的影響

曹 冶，于吉峰，謝 晶 ，張先惠，彭廣能，鐘志軍，康潤敏

(1.四川省畜牧科學研究院，四川 成都 610066；2. 動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川 成都 610066；3.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，四川 成都 611130)

【研究意義】近年來，隨著國民經(jīng)濟的快速發(fā)展，人們生活水平的不斷提高，伴侶動物特別是寵物犬和貓的數(shù)量增長迅猛。據(jù)統(tǒng)計，2018年我國城鎮(zhèn)養(yǎng)狗人數(shù)達3390萬，且寵物行業(yè)依然保持著27 %的年增長速率[1]，如何保證其健康已成為寵物行業(yè)面臨的重大問題。維生素A又稱視黃醇(其醛衍生物視黃醛)，是一個具有酯環(huán)的不飽和一元醇，是人類與動物所必需的營養(yǎng)素[2]。維生素A中毒是由于動物長期過量攝入富含維生素A的食物，引起維生素A過剩癥，在伴侶動物的養(yǎng)殖過程中時有發(fā)生，主要是由于飼喂全價日糧的同時長期大量飼喂肝臟，致使維生素A在動物體內(nèi)發(fā)生蓄積，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為骨質疏松，易骨折，韌帶和肌腱附著處的骨膜發(fā)生增生性病變，被毛稀疏、易脫等，特別是幼年動物極易出現(xiàn)四肢關節(jié)腫脹、跛行等骨骼發(fā)育不良等癥狀[3-5]，但目前尚無治療動物維生素A中毒的特效藥物。因此，研發(fā)能有效治療動物維生素A中毒的藥物對確保伴侶動物醫(yī)療健康發(fā)展具有重要意義。【前人研究進展】維生素A主要儲存在動物肝臟中，過量維生素A會導致肝腫大、壞死等病理變化[6-7]；在其他組織中也存在維生素A儲存，但不同動物間的肝外維生素A儲存差異明顯[8-11]。這可能是由于維生素A的狀態(tài)及改變維生素A狀態(tài)或代謝的潛在疾病過程所造成，有望成為動物維生素A中毒診斷的潛在手段。雖然已證實過量攝入維生素A與骨骼發(fā)育不良等癥狀存在關聯(lián)，但導致中毒的攝入量尚無法確定，可能還與其他營養(yǎng)因素協(xié)同發(fā)揮作用導致中毒有關[12-16]。對于動物維生素A中毒目前尚無特效的診斷和治療方法，以犬為例，主要是立即停止飼喂富含維生素A的食物(動物肝臟等)或飼料，并進行對癥治療。對于關節(jié)腫脹、跛行的患犬，可按照0.5～1.0 mg/kg的劑量肌肉注射地塞米松，每天 1次，連用3～5 d，同時肌肉注射維生素B1、B6和B12混合液；或口服安宮牛黃丸(1/3粒，約1.0 g)和大活絡丸(1/3粒，約1.2 g)，每天2次，連用15 d。但臨床實踐證明，這些治療效果并不理想[17]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在維生素A急性中毒4周左右開始出現(xiàn)關節(jié)腫脹、跛行等癥狀，在其生化指標上表現(xiàn)為血清谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)活性達峰值，血清鈣(Ca)含量達峰值；急性中毒8周左右，癥狀愈加明顯，而血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、血清鈣仍居高不下。因此，把小鼠在生素A的急性中毒8周左右認定為維生素A的急性中毒中晚期。【本研究切入點】我國中藥資源非常豐富，且有著悠久的中藥用藥歷史，若能從尋找到治療維生素A早期急性中毒的藥物及組方，對解決伴侶動物健康喂養(yǎng)問題具有重要意義。【擬解決的關鍵問題】研究中藥提取物及其組方對小鼠維生素A中晚期急性中毒的治療效果，為動物維生素A急性中毒提供有效的治療手段，進而促進伴侶動物醫(yī)療的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康成年昆明種小鼠36只，體質量18～22 g，公母各半，購至四川大學華西醫(yī)院實驗動物中心。在25～28 ℃環(huán)境種飼養(yǎng)2～3 d后。一次性腹腔注射維生素A(1500 mg/kg計量)，形成急性中毒模型小鼠，作為實驗動物。在中毒8周后開始治療實驗。

將維生素A中毒致骨發(fā)育不良綜合癥動物，隨機分成6組，每組6只小鼠。第1組為空白對照組(T1)，不給藥；第2組為趕黃草水粗提物治療組(T2)，按10.0 mL/kg的劑量連續(xù)灌胃給藥7 d；第3組為波棱瓜子粗提油治療組(T3)，按1.0 mL/kg的劑量連續(xù)灌胃給藥7 d；第4組為趕黃草水粗提物+波棱瓜子粗提油治療組(T4)，按5.0 mL/kg趕黃草水粗提物+0.5 mL/kg波棱瓜子粗提油連續(xù)灌胃給藥7 d；第5組為趕黃草水粗提物+波棱瓜子粗提油+黃芪多糖治療組(T5)，按5.0 mL/kg趕黃草水粗提物+0.5 mL/kg波棱瓜子粗提油+1.0 g/kg黃芪多糖(一級品)連續(xù)灌胃給藥7 d；第6組為陽性對照(T6)，取安宮牛黃丸作為藥品(1/3粒，約1 g)，連續(xù)灌胃給藥7 d。

1.2 中藥提取及處理

中藥波棱瓜子、趕黃草，一級品，購至成都中藥材批發(fā)市場。

稱取100 g波棱瓜子粉末，用濾紙包好后，放入索氏抽提器中，加入石油醚索氏提取6 h，回收石油醚提取物，旋轉蒸干溶劑，得到50 mL波棱瓜子粗提油。

稱取100 g趕黃草粉末，用濾紙包好后，放入索氏抽提器中，加入蒸餾水索氏提取6 h，回收提取物，水浴蒸干溶劑，用蒸餾水重溶，得到60 mL趕黃草水粗提物。

1.3 實驗方法及試劑

實驗小鼠在治療開始第2、4、6、8天分別采靜脈血進行血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、鈣(Ca)、堿性磷酸酶(ALP)、甲狀腺旁素(PTH)測定。

小鼠谷丙轉氨酶(ALT)測定試劑盒、小鼠血清谷草轉氨酶(AST)測定試劑盒、小鼠血清堿性磷酸酶(ALP)測定試劑盒、小鼠血清甲狀腺旁素(PTH)測定試劑盒購至武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司。小鼠血清鈣(Ca)測定試劑盒、小鼠血清磷(P)測定試劑盒購至南京建成生物工程研究所。黃芪多糖(一級品)購至華牧康獸藥商城。石油醚、乙醇均為分析純。

1.4 測定

取分離后的血清0.2 mL，按試劑盒所述方法進行測定AST，ALT，Ca，P，ALP，PTH。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，差異顯著時用ANOVA過程進行多重比較，以P<0.01(差異極顯著)和P<0.05(差異顯著)作為差異顯著性判斷標準，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 對維生素A急性中毒小鼠血清谷丙轉氨酶(ALT)的影響

從表1可知，通過對維生素A急性中毒小鼠血清谷丙轉氨酶(ALT)測定發(fā)現(xiàn)，T1組的血清ALT未見明顯變化，第2、4、6、8天分別為(10.66±0.28)、(9.90±0.30)、(9.79±0.14)、(10.26±0.51)ng/mL；T2組從第6天開始下降，全期有輕度下降，第2、4、6、8天分別為(8.76±0.29)、(8.58±0.26)、(7.73±0.29)、(7.04±0.06)ng/mL；T3組全期有明顯下降，第2、4、6、8天分別為(9.75±0.23)、(8.23±0.17)、(6.80±0.11)、(4.56±0.16)ng/mL；T4組全期有更為明顯下降，第2、4、6、8天分別為(9.92±0.20)、(6.72±0.29)、(4.36±0.14)、(3.11±0.02)ng/mL；T5組為所有治療方式中下降最為明顯的，第2、4、6、8天分別為(10.01±0.2)、(6.68±0.19)、(4.33±0.14)、(2.84±0.12)ng/mL；T6組效果也非常明顯，第2、4、6、8天分別為(11.17±0.08)、(7.14±0.21)、(5.24±0.17)、(3.70±0.10)ng/mL。

2.2 對維生素A急性中毒小鼠血清谷草轉氨酶(AST)的影響

從表2可知，通過對維生素A急性中毒小鼠血清谷草轉氨酶(AST)測定發(fā)現(xiàn)，T1組的血清AST未見明顯變化，第2、4、6、8天分別為(1892.51±35.91)、(1776.75±67.54)、(1756.16±20.47)、(1893.43±43.37)pg/mL；T2組全期下降明顯，第2、4、6、8天分別為(2146.15±66.87)、(1774.14±56.46)、(1272.85±5.71)、(843.97±15.85)pg/mL；T3組全期下降緩慢，第2、4、6、8天分別為(1743.40±49.45)、(1518.96±49.75)、(1240.57±35.84)、(866.26±37.89)pg/mL；T4組全期有較為明顯下降，第2、4、6、8天分別為(2173.82±25.74)、(1226.74±81.64)、(901.92±40.52)、(489.48±5.25)pg/mL；T5組為所有治療方式中下降也比較明顯，第2、4、6、8天分別為(1790.28±64.39)、(1291.45±93.86)、(840.12±93.86)、(519.00±41.57)pg/mL；T6組效果就比較一般，第2、4、6、8天分別為(1930.94±122.11)、(1658.08±23.21)、(1492.68±39.29)、(1180.46±41.49)pg/mL。

表1 各種藥物治療維生素A急性中毒小鼠的血清谷丙轉氨酶變化情況

表2 各種藥物治療維生素A急性中毒小鼠的血清谷草轉氨酶變化情況

表3 各種藥物治療維生素A急性中毒小鼠的血清鈣變化情況

2.3 對維生素A急性中毒小鼠血清鈣(Ca)的影響

從表3可知，通過對維生素A急性中毒小鼠血清鈣(Ca)測定發(fā)現(xiàn)，T1組的血清Ca未見明顯變化，第2、4、6、8天分別為(11.01±0.31)、(10.74±0.27)、(11.16±0.40)、(11.15±0.45)mmol/L；T2組有較為明顯的下降，第2、4、6、8天分別為(11.29±0.38)、(9.80±0.47)、(6.98±0.32)、(3.94±0.37)mmol/L；T3組趨勢與趕黃草水粗提物治療組相似，第2、4、6、8天分別為(12.03±0.48)、(8.58±0.36)、(6.05±0.83)、(4.20±0.38)mmol/L；T4組全期明顯下降，第2、4、6、8天分別為(12.36±0.52)、(7.31±0.77)、(3.77±0.29)、(2.59 ±0.61)mmol/L，第6天后回到正常值。T5組也下降明顯，趨勢與趕黃草水粗提物+波棱瓜子粗提油治療組相似，第2、4、6、8天分別為(11.55±0.32)、(7.58±0.28)、(4.33±0.32)、(2.91±0.29)mmol/L；T6組無顯著變化，第2、4、6、8天分別為(12.31±0.60)、(12.31±0.42)、(12.25±0.40)、(12.61±0.40)mmol/L。

2.4 對維生素A急性中毒小鼠血清磷(P)的影響

從表4可知，通過對維生素A急性中毒小鼠血清磷(P)測定發(fā)現(xiàn)，T1組的血清P未見明顯變化，第2、4、6、8天分別為(2.64±0.13)、(2.37±0.06)、(2.39±0.07)、(2.42±0.11)mmol/L；T2組有較為明顯的下降，第2、4、6、8天分別為(3.15±0.12)、(3.43±0.22)、(2.71±0.10)、(2.27±0.14)mmol/L；T3組趨勢與趕黃草水粗提物治療組相似，第2、4、6、8天分別為(3.54±0.10)、(3.14±0.04)、(2.72±0.07)、(1.96±0.10)mmol/L；T4組全期明顯下降，第2、4、6、8天分別為(3.09±0.10)、(3.36±0.30)、(2.69±0.08)、(2.07±0.08)mmol/L；T5組也下降明顯，趨勢與趕黃草水粗提物+波棱瓜子粗提油治療組相似，第2、4、6、8天分別為(3.19±0.11)、(3.85±0.12)、(1.97±0.07)、(1.98±0.12)mmol/L；T6組無顯著變化，第2、4、6、8天分別為(3.21±0.18)、(3.43±0.20)、(3.28±0.15)、(3.23±0.11)mmol/L。

表4 各種藥物治療維生素A急性中毒小鼠的血清磷變化情況

圖1 各種藥物治療維生素A急性中毒小鼠的血清鈣磷比變化情況

本次實驗采用藥物治療降低維生素A急性中毒所致小鼠骨癥狀時，波棱瓜子粗提油和趕黃草水粗提物導致了血清中的鈣磷比提高，兩者聯(lián)合后，血清中的鈣磷比進一步提高(圖1)。

2.5 對維生素A急性中毒小鼠血清堿性磷酸酶(ALP)的影響

從表5可知，通過對維生素A急性中毒小鼠血清堿性磷酸酶(ALP)測定發(fā)現(xiàn)，T1組的血清ALP未見明顯變化，第2、4、6、8天分別為(8.54±0.16)、(8.65±0.19)、(8.84±0.30)、(8.82±0.39)ng/mL；T2組，全期下降明顯，第2、4、6、8天分別為(9.66±0.23)、(7.42±0.63)、(5.76±0.35)、(2.98±0.19)ng/mL；T3組也有明顯下降，相較于其它治療組要緩慢性，第2、4、6、8天分別為(10.24±0.33)、(7.42±0.17)、(5.60±0.23)、(4.14±0.47)ng/mL；T4組全期有明顯下降，速度與處理2、處理5差不多，第2、4、6、8天分別為(9.82±0.44)、(5.42±0.35)、(3.04±0.33)、(1.72±0.39)ng/mL；T5組下降也較為明顯，第2、4、6、8天分別為(9.52±0.90)、(6.15±0.42)、(3.44±0.62)、(2.06±0.43)ng/mL；T6組效果也比較明顯，稍遜于處理2、處理4、處理5，第2、4、6、8天分別為(9.61±0.72)、(7.64±0.38)、(6.91±0.22)、(4.51±0.27)ng/mL。

2.6 對維生素A急性中毒小鼠血清甲狀腺旁素(PTH)的影響

從表6可知，通過對維生素A急性中毒小鼠血清甲狀腺旁素(PTH)測定發(fā)現(xiàn)，T1組的血清PTH未見明顯變化，第2、4、6、8天分別為(110.51±14.83)、(123.71±5.14)、(139.95±11.67)、(133.88±5.77)pg/mL；T2組全期升高明顯，第2、4、6、8天分別為(106.17±12.91)、(188.96±26.82)、(251.71±10.41)、(287.63±13.03)pg/mL；T3組也有明顯升高，趨勢與處理2類似，第2、4、6、8天分別為(135.31±3.58)、(183.19±9.58)、(263.31±2.99)、(317.07±8.27)pg/mL；T4組全期升高較為迅速，第2、4、6、8天分別為(193.90±10.14)、(281.80±10.24)、(295.84±9.75)、(351.15±8.69)pg/mL；T5組升高也比較明顯，趨勢與處理4類似，第2、4、6、8天分別為(194.67±6.77)、(285.25±4.85)、(304.11±9.99)、(348.95±5.49)pg/mL；T6組效果有輕度升高，第2、4、6、8天分別為(97.90±5.40)、(108.66±16.86)、(119.31±10.90)、(129.60±16.03)pg/mL。

表5 各種藥物治療維生素A急性中毒小鼠的血清堿性磷酸酶變化情況

表6 各種藥物治療維生素A急性中毒小鼠的血清甲狀腺旁素變化情況

3 討 論

趕黃草(PenthorumchinensePursh.)又名扯根菜、水澤蘭、水楊柳等，為虎耳草科植物扯根菜的地上部分，是苗族民間治療肝病的經(jīng)驗方，具有清熱解毒、退黃化濕、活血散瘀及利水消腫等功效[18-19]。波棱瓜子為葫蘆科植物波棱瓜[Herpetospermumcaudigerum(Ser.) C. B. Clarke]的干燥成熟種子，是一種常用藏藥，具有清膽熱、瀉肝火及治療消化不良等功效[20-21]。鑒于此，本研究選用波棱瓜子粗提油和趕黃草水粗提物治療維生素A急性中毒小鼠，結果顯示，趕黃草水粗提物和波棱瓜子粗提油均具有治療維生素A急性中毒所致小鼠骨損傷的功效。而二者合用且配以免疫增強劑黃芪多糖一起治療維生素A急性中毒，不僅可治療維生素A急性中毒所致小鼠骨損傷，而且還可治療維生素A急性中毒所致肝損傷，不僅能修復肝損傷，還能加快壞死的肝細胞代謝，從而達到糾正肝功能的目的。趕黃草水粗提物+波棱瓜子粗提油+黃芪多糖治療維生素A急性中毒效果大大優(yōu)于陽性對照組安宮牛黃丸。

谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)是衡量動物肝功能的2個重要的生化指標。其中ALT主要存在于肝細胞漿內(nèi)， AST主要分布在肝細胞漿和肝細胞的線粒體中。正常時，只有少量釋放入血液中；肝細胞壞死時，ALT和AST就會大量釋放入血液中，血清中濃度升高，其升高的程度與肝細胞受損的程度相一致。在肝功能檢查中，ALT是反映肝細胞受損的指標的，而AST是反映肝細胞壞死的標準[22-23]。從本次實驗的結果來看，波棱瓜子粗提油對降低維生素A急性中毒所致ALT升高效果略優(yōu)于趕黃草水粗提物，兩者的聯(lián)合作用的效果由進一步的提高，優(yōu)于單個作用組，在其中加入黃芪多糖，效果進一步提升，略優(yōu)于安宮牛黃丸。在所有參試治療方案中達到最佳。這可能是由于黃芪多糖具有激發(fā)自身免疫力的功效所致。而對于AST而言，趕黃草水粗提物對降低維生素A急性中毒所致AST升高效果最佳，優(yōu)于波棱瓜子粗提油，略優(yōu)于兩者混合。均優(yōu)于安宮牛黃丸的療效?？傮w而言，趕黃草水粗提物+波棱瓜子粗提油+黃芪多糖治療維生素A急性中毒所致肝損傷效果最佳，不但能修復肝損傷，也能加快壞死的肝細胞代謝，從而達到糾正肝功能的目的，效果大大優(yōu)于對照組安宮牛黃丸。

鈣，磷是構成動物骨組織的重要組成元素，約80 %的磷，99 %以上的鈣以磷酸鈣形式貯存在骨骼中。游離的血清鈣、磷濃度升高和降低均在某種程度上反映了動物骨組織出現(xiàn)的變化[24]。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)：小鼠出現(xiàn)骨癥狀時，其血清鈣大幅升高，血清磷有小幅升高，從而導致血清中鈣磷比大幅升高。從本次實驗的結果來看，波棱瓜子粗提油和趕黃草水粗提物均能大幅降低維生素A急性中毒所致小鼠血清鈣、磷濃度，兩者聯(lián)合，效果更佳，降低幅度更大。而對照組安宮牛黃丸卻不具備此項功效，它對降低維生素A急性中毒所致小鼠血清鈣、磷濃度功效不彰。但是，本次實驗采用藥物治療降低維生素A急性中毒所致小鼠骨癥狀時，波棱瓜子粗提油和趕黃草水粗提物導致了血清中的鈣磷比提高，兩者聯(lián)合后，血清中的鈣磷比進一步提高。這可能是由于動物在修復損傷的骨組織時，需要大量的鈣磷元素來重構骨組織，而損傷時，只有大量的鈣釋放出血液中，所以骨組織修復時，為了達到平衡，需攝入更多的磷來補充，從而導致血清中的鈣磷比提高。

堿性磷酸酶(ALP)是廣泛分布于動物肝臟、骨骼、腸、腎和胎盤等組織經(jīng)肝臟向膽外排出的一種酶[25]。這種酶能催化核酸分子脫掉5’磷酸基團，從而使DNA或RNA片段的5’-P末端轉換成5’-OH末端。但它不是單一的酶，而是一組同功酶。目前已發(fā)現(xiàn)有ALP1、ALP2、ALP3、ALP4、ALP5與ALP6 6種同功酶。其中第1、2、6種均來自肝臟，第3種來自骨細胞，第4種產(chǎn)生于胎盤及癌細胞，而第5種則來自小腸絨毛上皮與成纖維細胞。臨床上測定ALP主要用于骨骼、肝膽系統(tǒng)疾病的診斷和鑒別診斷，其病理性升高特別反映了肝損傷所致骨損傷的情況。從本次實驗的結果來看，趕黃草水粗提物降低維生素A急性中毒所致小鼠血清ALP效果優(yōu)于波棱瓜子粗提油，兩者聯(lián)合使用時，降低血清ALP效果與趕黃草水粗提物類似，優(yōu)于對照組安宮牛黃丸。

甲狀腺旁素(parathyroid gland，PTH)是含有84個氨基酸殘基的直鏈多肽，分子量為9500，其生物活性取決于氨基端的第1～27位氨基酸殘基。PTH是體內(nèi)維持血鈣穩(wěn)態(tài)的主要激素，總的效應是升高血鈣和降低血磷水平[26]。反映了血清鈣磷比變化情況。本次實驗的結果來看，趕黃草水粗提物和波棱瓜子粗提油由于其具有修復維生素A急性中毒所致小鼠骨損傷的功效，所以導致了PTH的顯著升高。而兩者的聯(lián)合作用，修復骨損傷效果更強，所以導致了PTH的進一步升高。而安宮牛黃丸不具有修復骨損傷功效，所以PTH濃度變化不大。

總而言之，通過本次實驗發(fā)現(xiàn)，趕黃草水粗提物和波棱瓜子粗提油均有治療維生素A急性中毒所致小鼠骨損傷的功效，兩者聯(lián)合使用，效果更佳。特別是趕黃草水粗提物+波棱瓜子粗提油+黃芪多糖的藥物治療組合，療效最佳。優(yōu)于傳統(tǒng)治療藥物安宮牛黃丸。