‘唐元韭黃’采后常溫貨架期致腐病原菌的分離與鑒定

王祖蓮，陳 晴，李煥秀，羅芳耀，朱永清，郭云建，高 佳*

(1.四川省農業科學院農產品加工研究所，四川 成都 610066；2.四川農業大學園藝學院，四川 成都 611130；3.成都市郫都區農業農村和林業局，四川 成都 611730)

【研究意義】韭黃，百合科(Liliaceae)蔥屬(Allium)多年生草本植物，又名韭芽、黃韭芽等，是韭菜(A.tuberosumRottl. ex Spreng.)的宿根通過無光軟化栽培生產的一種特色蔬菜，其葉片黃白、質地細嫩、香氣濃郁，在我國多地廣泛栽種[1]。韭黃富含豐富的維生素、蛋白質、礦物質以及揮發性硫化物，具有較高的營養和保健價值，用于食療有溫中、行氣、散血、解毒等功效[2-3]。四川韭黃栽培歷史悠久，其中成都市郫都區唐元鎮被譽為“四川省韭黃之鄉”[4]，‘唐元韭黃’更是被授予國家地理標志保護產品稱號，遠銷國內外。‘唐元韭黃’葉片生長較長，通?？蛇_60～80 cm，質地脆嫩，含水量高，采后呼吸代謝旺盛，商品化處理和貯運過程中易受機械損傷，造成葉片折斷破損，夏季高溫下放置2～3 d就會產生萎蔫、軟化、腐爛、霉變等現象，極大地限制了產品的銷售半徑?！厩叭搜芯窟M展】目前，國內外關于韭黃采后研究的報道較少，集中在采用丙二醛[1]、二氧化氯[5]、1-甲基環丙烯(1-MCP)[6]等不同的化學保鮮劑或保溫箱[7]等物理設施來延長產品貨架期上，而關于導致韭黃采后由病原菌引起的腐損關注較少。韭黃種植過程中需要對韭菜宿根進行避光覆蓋軟化栽培，高溫、高濕環境下田間攜帶的病原菌種類和數量較多。研究顯示韭黃種植過程中發現的由煙草疫霉寄生變種交配型A1(Phytophthoranicotianaevar.parasitica)引起的韭黃爛葉病[8]，也有研究報道韭菜種植過程中發現了黃葉病(草生歐文氏菌菠蘿變種Erwiniaherbicolavar.ananas)[9]、綿疫病(樟疫霉PhytophthoracinnamomiRand)[10]、白絹病(SclerotiumrolfsiiSacc.)[11]、灰霉病(蔥鱗葡萄孢菌BotrytissquamosaWalker)[12]、根腐病(鐮孢菌Fusarium)[13]等。【本研究切入點】韭黃采前病害的種類受種植環境與栽培條件影響較大，采前病害與采后病害有相關性也存在差異?！緮M解決的關鍵問題】因此，本文以‘唐元韭黃’為研究對象，初步分離鑒定了導致韭黃采后腐爛的主要病原菌，以期為探明四川地區韭黃采后致腐病原菌種類提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病害調查及病原菌分離、純化和保藏 2018年9月，采集四川省成都市郫都區唐元鎮青楊韭黃專業合作社的新鮮無病癥的葉片，置于常溫[(20±0.5) ℃]下72 h，后調查病害發生情況，并描述病害癥狀。

致病病原菌分離于貯藏過程中具典型發病癥狀的韭黃葉片上，在無菌操作臺上純化菌株，分離培養溫度分別為30 、37 ℃，分離好的菌株防置于4 ℃的冰箱進行短期貯藏。

1.1.2 化學試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)和平板計數瓊脂(PCA,北京陸橋技術股份有限公司)；革蘭氏染色料(杭州微生物試劑有限公司)；香柏油分析純(中國上海懿洋有限公司)；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]；瓊脂糖(上海玉博生物科技有限公司)；氯化鈉、無水乙醇等常規試劑為分析純(成都市科隆化學品有限公司。

1.1.3 設備儀器 高壓滅菌鍋MM400[致微(廈門)儀器有限公司]；生物安全柜ESCD class Ⅱ BSC AC 2-6S1[新加坡藝思高科技有限公司]；恒溫培養箱LRHS-150-Ⅱ(上海躍進醫療器械有限公司)；顯微鏡OLYMPUS CX41RF[奧林巴斯(中國)有限公司]；PCR儀FlexCycle(德國耶拿分析儀器股份公司)；冷凍離心機5424[Eppendorf (中國)有限公司]。

1.2 試驗方法

1.2.1 致腐病原菌的分離與純化 (1)致腐病原菌的分離。常溫貯藏的發病韭黃，經無菌水清洗后于濾紙上晾干，采用組織分離法[14]，將分離的韭黃感病組織置于PCA及PDA培養基上，于37 ℃或30 ℃恒溫培養2～3 d。

(2)致腐病原菌的純化。PDA培養基：待分離的病原真菌菌落生長至直徑1 cm時，切取菌落外端菌絲與培養基相接觸的菌塊，挑取菌塊放置在新的PDA培養基上重新培養，以上步驟重復3次。

PCA培養基：采用點接法[15]進行純化備用。

1.2.2 致病性鑒定 對接種點采用“針刺”和“不處理”2種方式將分離的純培養物接種于健壯的韭黃葉片上，25 ℃下培養3～5 d，待發生腐爛現象后，從腐爛處分離致腐病原菌，與自然發病的癥狀進行比較，并通過韭黃產生病害的發展速度和發展程度，評價其病原菌對韭黃的致病能力[16]。

1.2.3 致腐病原菌形態學鑒定 (1)致腐病原菌的形態學特征觀察。將分離出的真菌和細菌分別接種于PDA及PCA培養基上，放置于37 和25 ℃下培養5～7 d，記錄菌落形態特征和顏色。

(2)致腐病原菌的顯微特征觀察。將培養好的真菌直接制片，細菌經革蘭氏染色后制片，在顯微鏡下觀察，記錄其特征。

1.2.4 致腐病原菌的分子生物學鑒定 將韭黃采后主要致腐病原菌分別置于PDA和PCA培養基上培養，并純化得到單一菌株，在相應的液體培養基振蕩培養3～5 d，采用上海生工真菌、細菌基因組DNA抽提試劑盒(Ezup柱式)分別提取DNA。rDNA ITS擴增分別采用真菌核糖體基因轉錄間隔區(ITS)通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，以及細菌核糖體基因轉錄間隔區(16S rDNA)通用引物27F(5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反應體系及PCR反應程序參考試劑盒說明。將PCR產物進行電泳檢測，然后送樣至生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序，通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的BLAST軟件與數據庫中的已知序列進行同源性比較，再利用MEGA軟件構建進化樹。

2 結果與分析

2.1 自然發病表現癥狀及發病特點

將韭黃放置在常溫(25±0.5)℃下貯藏，3～5 d就會出現腐爛現象(圖1)。韭黃白霉(圖1-a)多從萎蔫葉片上發病，先產生大量白色菌絲，后逐步擴散導致周圍葉片迅速萎蔫失去商品價值。黑斑癥狀(圖1-b)，以韭黃莖受害為主，初期呈針尖狀褐色小斑，后逐漸擴散呈明顯的黑色斑點，有的病斑后期會產生白色的霉狀物，導致貯藏后期韭黃莖商品性降低并軟化易折損。

黑斑病是農作物的主要真菌性病害之一，在百合科植物上也較常見，石蘊璉等[17]對蒜薹貯藏期黑斑病研究表明，其初期癥狀呈“針尖狀”小黃斑，少數中間凹陷，病斑產生褐色或黑褐色霉狀物，其病原微生物經鑒定為匐柄霉{StemphyliumbotryosumWallr.[st.perf.=Pleosporaherbarum(Fr.)Rabenh.]}。水爛癥狀(圖1-c)是引起韭黃商品性劣變的主要病害現象之一，主要發生在韭黃葉片上。發病時先從幼嫩葉片邊緣產生水浸現象，1～2 d后迅速擴散至整葉乃至整株植株，并伴隨著大量組織粘液的滲出和刺激性不良氣味產生，莖稈和葉片軟腐。現有研究關于韭黃采后病害報道較少，尚未查見有關水爛癥狀的描述，但在韭菜田間栽種時有報道過類似的一種暗褐色水漬狀真菌病斑，其病部出現白色霉層，易引起葉片下垂腐爛，病原微生物經鑒定為疫霉屬(Phytophthora)真菌[18]；此外也有報道在當歸的田間種植時出現“水爛病”，其癥狀為葉基部呈水漬狀，然后萎蔫導致整個植株地上部分枯死，地下根腐爛，病原微生物經鑒定為熒光假單胞桿菌第2生物型(Pseudomonas fluorescens 生物型Ⅱ)[19]。

2.2 室內回接表現癥狀及致腐病原菌的鑒定

2.2.1 致腐病原菌的分離和純化 從出現先病癥的韭黃樣品中分別對“水爛”、“白霉”以及“黑斑”分別取樣分離，然后根據平板上的菌落特征對分離的致腐病原菌進行純化培養，分離得到1株細菌和1株真菌。

2.2.2 致腐病原菌的確定 依柯赫氏法則[16]將分離的1株細菌和1株真菌分別接種到新鮮健康的韭黃上進行致病力鑒定，初步確定這2種病原菌具有較強的致病力，分別編號為j-1、j-2。重新將這2株菌接種到新鮮健康的韭黃莖稈上，再次從接種后腐爛的韭黃組織分離致腐病原菌，純化培養得到與j-1和j-2形態相似的病原菌。

將分離到的菌株分別采用“有傷”和“無傷”2種接種方式[20]回接到健康韭黃莖稈上，置于25 ℃室內貨架存放3 d，觀察到接種j-1菌絲塊的韭黃莖全部發生腐爛現象，且有傷接種比無傷接種發病更快(圖2-a)；接種j-2細菌的韭黃莖在接種后5 d時，有傷接種的腐爛發生率超過80.00 %，但無傷接種未出現明顯癥狀，對照組也未發病(圖2-b)。將腐爛的韭黃再次進行致腐病原菌的二次分離，得到與接種菌形態相同的致腐病原菌。根據柯赫氏法則[16]，證明j-1和j-2兩株接種菌都是導致韭黃腐敗的致腐病原菌，且與自然發病的癥狀相似；菌株毒力測定結果表明，j-1菌株的致病性比j-2菌株強。

a.韭黃葉片長霉癥狀；b.韭黃莖稈黑斑癥狀；c.韭黃水爛癥狀

a.j-1致病性鑒定；b.j-2致病性鑒定

2.2.3 致腐病原菌的鑒定 (1) 致腐病原菌形態特征的鑒定。j-1菌株為真菌，在PDA培養基上30 ℃恒溫培養5 d后，直徑達60 mm左右。其菌落呈規則圓形(圖3)，同心圓紋狀，菌絲生長緊密，部分表生顏色為粉白色，部分埋生背觀顏色為粉色，隨著溫度濕度的變化，菌落顏色可能會發生改變。顯微鏡下，其菌絲為有隔菌絲，產孢細胞為單瓶梗，常產生大量的小型分生孢子大小為2.5～5.0 μm，呈腎形或卵形。未觀察到大型分生孢子和厚垣孢子。參考真菌形態特征系統分類的相關資料[21]，初步鑒定菌株j-1為鐮刀菌屬。

j-2菌株為細菌，在PCA培養基上37 ℃培養3～5 d后，菌落直徑達到1 cm左右(圖4)，菌落近乎圓形，邊緣呈鋸齒形，整個菌落外一圈近乎透明，且有光澤，而內圈呈淡黃色凸起狀。經革蘭氏染色(圖4-c，d)鑒定j-2為桿狀革蘭氏陰性菌，專性好氧菌。

a.j-1正面形態特征；b.j-1背面形態特征；c.j-1菌絲孢子特征；d.j-1孢子；e.j-1菌絲

a.j-2正面形態特征；b.j-2背面形態特征；c.光學顯微鏡下j-2的菌體形態；d.光學顯微鏡下j-2革蘭氏染色的菌體形態

a.j-1菌株；b.j-2菌株

(2) 致腐病原菌rDNA iTS及16S rDNA擴增及序列分析。提取j-1菌株的DNA模板，利用引物ITS1和ITS4對j-1進行PCR擴增，得到了500 bp左右的條帶(圖5)。對j-1進行測序后，將所得到的序列使用NCBI上數據庫中的BLAST進行比對分析(圖6)。結果表明，與j-1比對結果為100.00 %的菌株種類均為Fusariumoxysporum，其中同源性菌株的登錄號有MK192050.1、KY114145.1、KU939047.1、KU939046.1、KY775616.1、KX253980.1、KR7086 47.1、EU839382.1、EU839372.1和EU839365.1。結合j-1形態特征的觀察，最終確定其為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)。

提取j-2菌株的DNA模板，利用引物27F和1492R對j-2進行擴增得到1300 bp左右的條帶(圖7)。對j-2進行測序后將所得到的序列結果在NCBI上的數據庫中進行BLAST比對分析(圖6)，與j-2比對結果為97.90 %的菌株種類均為黃單胞桿菌屬(Xanthomonadales)的變形菌，其中具有遺傳相似性的菌株的登錄號有NR 157765.1、NR 121739.1、NR 028930.1、NR 116793.1、NR 148818.1、NR 116366.1、NR 117406.1、NR 136457.1、NR 025577.1和NR 134219.1；其中與登錄號為NR 157765.1的親緣關系最近(支持率為97.90 %)，其為嗜麥芽單胞菌(Stenotrophomonasbentonitica)，與登錄號為NR 025577.1以及NR 134219.1的親緣關系較遠。結合j-2形態特征的觀察，最終確定其為黃單胞桿菌屬(Xanthomonas)中的一種嗜根寡養單胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)。

圖6 j-1 rDNA ITS序列聚類圖

圖7 j-2 rDNA ITS序列聚類圖

3 討 論

由病原微生物引起的腐爛是造成果蔬采后腐損的主要原因之一，其中鐮刀菌屬微生物因廣泛存在于土壤和植物體內，成為腐敗菌的重要來源[21-23]。Tonti等[24]的研究表明，鐮刀菌屬(Fusarium)是引起大蒜采后貯藏過程中腐爛的主要病原菌種類；李旭雙等[25]研究顯示，尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和層生鐮刀菌(F.proliferatum)是導致大蒜出現水浸狀病斑的主要致病菌，病斑產生后逐步蔓延至整個蒜瓣，使蒜瓣呈現黃褐色和干縮現象。對洋蔥采后病害的分離鑒定表明[26]，引起洋蔥腐爛的主要病原微生物為曲霉屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)、青霉屬(Penicillium)和根霉屬(Rhizopus)4類，其中以曲霉屬和根霉屬為主。張軍高等[27]從貯藏期大蔥腐敗組織中分離鑒定出層出鐮孢菌(Fusariumproliferatum)、尖孢鐮孢菌(FusariumoxysporumSchlecht)和燕麥鐮孢菌(F.avenaceum)3種致腐病原菌，其中層出鐮孢菌為大蔥鐮孢菌腐爛病的優勢致病菌，分離頻率為52.50 %。此外，細菌性病害也是導致百合科蔥屬植物腐爛的主要原因之一。Tomlinson等[28]報道金黃色假單胞菌(Pseudomonascepaci)可以引起受傷的洋蔥球莖發生軟腐?。粡堗嵉萚29]研究表明，假單胞菌屬(Pseudomonassp.)和洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)會導致洋蔥鱗莖腐爛性病害的發生。

本試驗從貨架貯藏過程中韭黃的“白霉水爛”和“黑斑”癥狀腐爛材料中分離出尖孢鐮刀菌(FusariumoxysporumSchlecht)致腐病原菌，與前人對大蒜干腐病[26]、洋蔥腐爛[25]等百合科蔥屬蔬菜采后病害的研究結果相似。但本試驗在韭黃“水爛”癥狀植株上還分離鑒定出一株黃單胞桿菌的變形菌嗜根寡養單胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)，該菌尚未在百合科蔥屬植物上有研究報道。有研究表明，黃單胞桿菌是造成油豆角貯藏期腐爛[30]和李細菌性穿孔[31]的主要致病病原菌。

4 結 論

本試驗從韭黃常溫貨架貯藏過程中的腐爛植株中分離鑒定出2株致腐病原菌，分別編號為1株真菌j-1和1株細菌j-2。經致病性鑒定表明，真菌j-1菌株對韭黃的致腐率達100.00 %，是導致韭黃腐爛的主要致腐病原菌；細菌j-2菌株對韭黃有傷接種的致腐率大于80.00 %，也是導致韭黃腐爛的重要致腐病原菌。對j-1和j-2菌株進行形態學特征鑒定和rDNA的ITS序列分析，證明j-1菌株為鐮刀菌屬(Fusarium)中的尖孢鐮刀菌(FusariumoxysporumSchlecht)，j-2菌株為黃單胞桿菌屬(Xanthomonas)中的嗜根寡養單胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)。