冬蟲夏草培殖中粉棒束孢病害動態變化規律

賀元川，游華建，魯增輝，陳仕江*

(1.重慶市中藥研究院，重慶 400065； 2.甘孜州康定貢嘎中華蟲草產業有限責任公司，四川 康定 626000)

【研究意義】冬蟲夏草Ophiocordycepssinensis(Berk) G.H. Sunget al.是冬蟲夏草菌(中國被毛孢)侵染青藏高原高山草甸土壤中的蝙蝠蛾幼蟲后形成蟲菌復合體，是我國傳統的名貴中藥材之一，與人參、鹿茸并列為我國“中藥三寶”，主要分布于青藏高原海拔3500～5000 m的高山草甸[1]。冬蟲夏草含有蟲草酸、多糖、腺苷、麥角甾醇等多種活性成分，在抗腫瘤、抗氧化、調節免疫等方面具有獨特的功效[2-4]。現代藥典記載冬蟲夏草“甘、平。歸肺，腎經。補腎益肺，止血化痰。用于腎虛精虧，陽痿遺精，腰膝酸痛，久咳虛喘，勞嗽咯血”[5]，因其獨特的藥用價值和保健價值備受關注和青睞。隨著高原生態環境的惡化及過度采挖，導致野生資源不斷減少，市場價格飆升，冬蟲夏草半野生撫育和人工培育也成為近年來關注的熱點。冬蟲夏草培殖過程中寄主昆蟲蝙蝠蛾蛾幼蟲粉棒束孢病害病害的發生直接響蝙蝠蛾幼蟲的存活率，間接影響冬蟲夏草的形成，成為制約冬蟲夏草產業化的重要瓶頸[6-7]。粉棒束孢Isariafarinosa(Holmsk)Fr.隸屬于擬青霉屬，廣泛分布于世界各地，雖然可作為生防菌用于害蟲的防治，但是在冬蟲夏草產業中，粉棒束孢被列為蝙蝠蛾幼蟲粉棒束孢病害的的主要病原真菌[6,8]。昆蟲病原菌宿存動態是昆蟲疾病流行學的重要組成部分。【前人研究進展】目前國內外學者主要對生防菌白僵菌、綠僵菌等昆蟲病原菌的宿存能力做了較多的研究，但是關于粉棒束孢的研究主要集中在防治、發病機理等的研究，而缺乏對粉棒束孢土壤中動態規律、影響因子和毒力變化的研究報道[9-11]。由于冬蟲夏草生長于高海拔高寒地帶，此環境下粉棒束孢病害在室內人工飼養環境發生比野外自然環境發生率高[6]，由此推測不同環境條件下，粉棒束孢的動態變化規律不同，導致病害發生率存在較大差異。目前對粉棒束孢病害的防控措施和手段集中于實驗室階段，極少落實到實際生產應用當中[8]，因此研究粉棒束孢在土壤中的傳播流行規律是探討有效的防治手段的基礎。【本研究切入點】為了明確粉棒束孢在冬蟲夏草寄主昆蟲蝙蝠蛾幼蟲適合環境下的流行傳播規律， 本課題研究了高海拔地區野外自然環境和室內飼養環境條件下的粉棒束孢在僵蟲體上和周圍土壤的宿存能力。【擬解決的關鍵問題】為后期粉棒束孢的有效防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

粉棒束孢菌株：分離于四川康定雅家梗蟲草基地粉棒束孢病害蟲；蝙蝠蛾幼蟲：康定雅家梗蟲草基地提供人工繁育飼養的蝙蝠蛾4齡蝙蝠蛾幼蟲；粉棒束孢萌發培養基：鏈霉素 100 U/mL，馬鈴薯200 g(去皮，切塊煮沸30 min，紗布過濾)，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1L，加水溶解，分裝后121 ℃滅菌20 min備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試僵蟲的準備 刮取在PDA培養基上充分產孢的粉棒束孢孢子，用含0.05 %吐溫80的無菌水配置成1×108個/mL濃度的孢懸液，用振蕩器充分震蕩混勻，將事先采集的大小一致的蝙蝠蛾4齡幼蟲在孢子懸液中侵染3 min，置于室溫下晾干后已消毒的胡蘿卜進行飼養，逐日進行觀察，挑取死去的蟲體，用75 %酒精進行表面消毒后，放于培養皿中進行保濕培養，待其僵化。

1.2.2 試驗小區的設置 在康定蟲草基地室外選擇5塊100 cm×100 cm的試驗小區，小區間隔距離約5 m，根據蝙蝠蛾幼蟲野生生活習性，揭開厚約10 cm草皮，模擬野外自然生長幼蟲環境從草皮下方傾斜30°打孔若干至地表，在草皮下方挖若干幼蟲大小的空穴，約1 cm放入孔穴凹槽內，并作出標記，模擬蝙蝠蛾僵蟲自然死亡狀態。每頭僵蟲的間距約15 cm，每小區25頭，編號并插上標簽。康定室內飼養盒作為試驗盒(30 cm×20 cm×15 cm)，介質為室內飼養幼蟲的腐殖土，每盒中心放置1頭僵蟲，模擬實際飼養情況在僵蟲周圍打孔若干個。

1.2.3 僵蟲樣品 選擇大小一致、僵化程度相當的蝙蝠蛾僵蟲進行以下試驗。野外實驗組將僵蟲埋入試驗小區，將125頭均勻一致的僵蟲埋入試驗小區，每隔10 d取1次蟲體，每次隨機取5頭僵蟲，測定每頭僵蟲上的孢子宿存量、萌發率和致病率。室內組則埋入試驗盒中心，取樣同野外。

1.2.4 孢子宿存量測定方法 將所取5頭蝙蝠蛾僵蟲分別放入盛有10 mL含0.05 %吐溫80無菌水的試管中，在振蕩器上進行震蕩5 min，使僵蟲體上孢子充分分散，稀釋后用血球計數板統計每頭僵蟲體上的攜孢量。

1.2.5 孢子萌發率測定方法 取樣品的孢子懸浮液梯度稀釋后取0.1 mL涂布于萌發培養基平板上，放入培養箱中20 ℃恒溫保濕培養4 d后統計平板孢子萌發形成的菌落情況，計算孢子平均萌發率。

1.2.6 土壤樣品處理 在僵蟲取樣完成后，用經75 %酒精擦拭過的稱量勺對其中心及周圍的土壤(以蟲體中心為圓心，用圓柱形取樣器(直徑4.5 mm)取樣器以半徑5 cm的同樣深度土壤范圍進行取樣，取樣厚度5 cm，且所取土樣量大體一致。將采集的土樣充分混勻，稱取1 g土樣放入裝有9 mL 0.05 %吐溫80滅菌水的離心管中，在振蕩器上振蕩15 min，使土壤充分溶解混勻，取土壤溶液進行10倍梯度遞減稀釋，用微量移液器精確移取各濃度土壤懸液0.1 mL于制好的選擇性培養基上，將土壤基液涂布均勻，各濃度均設3個重復。將平板置于20 ℃培養箱中，觀察、記錄各培養皿中粉棒束孢的成菌落數。選取適宜濃度的粉棒束孢成菌落數進行統計，計算1 g土樣中粉棒束孢的數量，換算成所取土壤中總的粉棒束孢菌落數。

1.2.7 粉棒束孢宿存孢子毒力測定 將每次取樣的制備的菌懸液稀釋至孢子濃度108個/mL，濃度不足則采用孢子液濃度，采用浸漬法接種至健康的4齡蝙蝠蛾幼蟲，晾干后單頭飼養，統計1周內的死亡總數，計算校正致死率。

2 結果與分析

2.1 粉棒束孢在蝙蝠蛾僵蟲體上宿存動態變化情況

從表1可以看出，前3個月僵蟲體粉棒束孢含孢量隨時間逐漸增加，3個月左右達到頂峰值，隨后3個月逐漸的降低至頂峰值的1/10。野外自然環境僵蟲體的粉棒束孢積累較室內飼養環境的慢，最大含孢量僅為室內環境的一半。孢子萌發率隨著宿存時間變化較小，但是室內飼養環境下的孢子萌發率和致病率均略高于野外自然環境。前3個月期粉棒束孢以僵蟲為營養不斷的生長積累，致病率也隨之增大，具有復壯的作用，但是后3個月隨著宿存量的降低，其中野外自然土壤中的粉棒束孢的致病率顯著減低，而室內飼養環境粉棒束孢略有降低，但均保持在80 %以上。本實驗以冬蟲夏草主要產區的氣候特征選擇在適合蝙蝠蛾幼蟲生長的康定雅家梗(海拔高度3800 m)蟲草基地進行，該基地雨水充沛，野外5-9月的降雨量平均120 cm，每月降雨時間約20～25 d，雨水的沖洗作用強烈，10月降雨時間大幅減少，降雨量明顯降低，氣溫開始下降，孢子宿存量變化變緩。在白僵菌野外實驗發現相似情況，野外受到氣候因素影響較大，此外由于野外僵蟲體周圍土壤微生物復雜，植物根系等對宿存量可能產生一定的影響[12-14]。

2.2 粉棒束孢在僵蟲體周圍土壤中的種群動態

從表2可以看出，在前期孢子生長階段，周圍土壤隨著僵蟲體孢子量的增加而增加，但土壤中孢子含量變化比僵蟲體孢子量變化延遲，野外環境周圍土壤粉棒束孢含量最大值在僵蟲體達到最大值后隨后出現頂峰，但是室內環境卻延遲了約1個月才達到最大值。在野外自然環境，周圍土壤粉棒束孢增速緩慢，含量比室內低一個數量級，僅達到107個/g，孢子萌發率降低至80 %～85 %，比僵蟲體低約10 %，致病率顯著降低，僅為20 %～30 %。在室內環境下孢子含量維持在108個/g，最高可達到109個/g，萌發率維持在90 %以上，周圍土壤粉棒束孢致病率均維持在50 %以上。僵蟲體上及周圍土壤中粉棒束孢宿存量及毒力測定結果顯示，前3個月僵蟲體粉棒束孢含孢量隨時間逐漸增加，周圍土壤粉棒束孢隨僵蟲體孢子量增加緩慢增長，隨后3個月土壤中粉棒束孢含量隨著僵蟲體的含量降低而逐漸減低，僅達到107個/g，孢子萌發率降低至80 %～85 %，比僵蟲體低約10 %，致病率顯著降低，僅為20 %～30 %，僵蟲體上粉棒束孢的致病率也降至50 %，孢子含量較巔峰衰減了90 %，由此推測強烈的雨水沖刷導致粉棒束孢孢子流失、分散加速。其次，該階段的溫度、濕度、土壤微生物和生長的植物根系可能會抑制粉棒束孢的生長及毒力。綠僵菌、白僵菌的僵蟲在土壤中由于雨水等作用，導致僵蟲體上孢子含量逐漸減少，而土壤中孢子含量增加的此消彼長的動態變化關系，粉棒束孢的中期變化過程與此相似[15-17]。

表1 蝙蝠蛾幼蟲僵蟲體上的粉棒束孢孢子宿存量、萌發率及致病率

表2 周圍土壤孢子宿存量、萌發率及致病率

2.3 粉棒束孢在僵蟲體上與周圍土壤中的宿存關系

從圖1～2可以看出，在粉棒束孢剛侵染蝙蝠蛾幼蟲早期，隨著粉棒束孢的生長，周圍土壤的粉棒束孢開始緩慢增加。野外自然環境，土壤中粉棒束孢含量變化趨勢基本和僵蟲體保持一致，略遲于僵蟲體達到含量最大值，在后期下降過程中，土壤中粉棒束孢含量下降比僵蟲體迅速。室內飼養環境土壤中的粉棒束孢呈現階梯式的上漲，積累的粉棒束孢含量顯著高于野外的含量，后期，僵蟲周圍土壤中粉棒束孢含量緩慢下降。

3 討論與結論

昆蟲病原菌在僵蟲體及周圍土壤中的宿存量和毒力的保存對疾病的流行和再傳播具有重要的影響，而環境的濕度、溫度、微生物種類、植物根際種類等均可能對病原真菌的宿存和毒力保持產生重要影響[15-20]。野外自然環境除了雨水的沖刷可降低粉棒束孢含量外，其土壤微生物和植物根系等對粉棒束孢的生長具有一定的抑制作用，導致室外粉棒束孢衰減較快，而室內飼養的環境中，豐富的營養物質等相對適合粉棒束孢的宿存和毒力保存，從而有利于粉棒束孢的再傳播。對野外土壤微生物的研究發現部分微生物對粉棒束孢生長具有拮抗作用，可抑制其生長，同時某些飼料根系在一定程度上也會抑制孢子的萌發。由于土壤中微生物種類繁多，具體的拮抗菌還需要經一步研究。冬蟲夏草野外生長的自然環境植被種類豐富，主要是蓼科、莎草科和禾草科植被，但是具體拮抗根系也需要經一步探索。

圖1 粉棒束孢在冬蟲夏草寄主蝙蝠蛾幼蟲僵蟲體上與周圍土壤中的宿存關系(室內)

圖2 粉棒束孢在冬蟲夏草寄主蝙蝠蛾幼蟲僵蟲體上與周圍土壤中的宿存關系(野外)

綜上所述，粉棒束孢病害的動態傳播具有一定的規律，一旦蝙蝠蛾幼蟲感染粉棒束，粉棒束孢快速致死幼蟲后即刻利用其營養物質進行大量的繁殖，產生大量的孢子，并向周圍土壤擴散或者在雨水作用下移動，周圍土壤孢子變化緊跟僵蟲其后，自然環境下，雨水的沖刷可快速移動和降低土壤中粉棒束孢的濃度，室內封閉環境則緩慢向周圍擴散，這可能是室內易爆發粉棒束孢病害的原因之一。