兜蘭萎蔫病病原菌的分離與鑒定

崔學(xué)強，李秀玲，范繼征，鄧杰玲，孫明艷，張自斌，黃昌艷，卜朝陽

(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】兜蘭(Paphiopedilum)又稱拖鞋蘭、仙履蘭，是蘭科(Orchidaceae)兜蘭屬植物的統(tǒng)稱，隸屬于杓蘭亞科(Cypripedioideae)，是蘭科中較原始的類群，也是蘭科植物中最具特色、最具經(jīng)濟價值和觀賞價值的類群之一[1-3]。近年來，兜蘭盆花以新奇特的審美成為花卉界新寵，其產(chǎn)業(yè)化規(guī)模也越來越大。但在兜蘭資源保護與產(chǎn)業(yè)化發(fā)展過程中，兜蘭萎蔫病(Paphiopedilumwilt disease)病害頻發(fā)，使其觀賞價值和商品價值極大降低，也嚴重影響兜蘭野生資源的遷地保護及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展進程，已成為兜蘭產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸，但目前有關(guān)兜蘭萎蔫病的研究鮮有報道。因此，明確引起兜蘭萎蔫病的病原菌，對研發(fā)有效防治藥劑及促進兜蘭產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。【前人研究進展】蘭花病害以真菌性病害為主，占蘭花病害的2/3以上[4]。兜蘭萎蔫病又稱蘭花萎蔫病[2]，分布廣，危害大，與蘭花炭疽病和蘭花黑腐病并稱為危害兜蘭的三大真菌性病害[5]。徐波等[6]明確了尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)為兜蘭莖腐病病原菌，并選出能抑制該病菌的8種有效殺菌劑。覃茜等[7]采用組織分離法對廣西雅長蘭科植物國家級自然保護區(qū)葉斑病蘭花植株進行病原菌分離，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征并結(jié)合多基因系統(tǒng)學(xué)對病原菌進行鑒定，發(fā)現(xiàn)蘭花葉斑病的致病菌為鐮刀菌。張志光等[8]開展兜蘭立枯病病原菌及頡抗菌防治研究，發(fā)現(xiàn)立枯絲核菌是兜蘭立枯病的主要病原菌，綠色木霉菌T8菌株對立枯絲核菌有明顯的拮抗作用。徐波等[9]采用組織分離法對具有典型癥狀的兜蘭炭疽病標本進行病原物分離培養(yǎng)，通過形態(tài)學(xué)觀察和rDNA ITS序列分析對兜蘭炭疽病病原菌進行鑒定，并開展兜蘭炭疽病病原菌室內(nèi)藥劑篩選，明確了膠孢炭疽菌為兜蘭炭疽病病原菌，并篩選出能抑制該病菌的4種有效殺菌劑。楊麗芬等[10]研究發(fā)現(xiàn)，膠孢炭疽菌是云南墨蘭炭疽病的主要病原菌，該病原菌對兜蘭具有一定的侵染性。焦鵬等[11]采用菌落直徑法和孢子萌發(fā)法測定并比較6種殺菌劑對蘭花枯萎病菌尖孢鐮刀菌的室內(nèi)抗菌活性，發(fā)現(xiàn)啶菌惡唑?qū)z生長和孢子萌發(fā)都有很強的抑制能力。連彩等[12]篩選出對蘭花枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌具有較強拮抗作用的高效菌株3A3-15菌株，經(jīng)鑒定該菌株為芽孢桿菌屬(Bacillusvelezensis)。黃鵬等[13]選擇6種殺菌劑對建蘭莖腐病病原菌尖孢鐮刀菌的毒力及聯(lián)合作用進行分析，結(jié)果表明苯醚甲環(huán)唑+多菌靈和多菌靈+肟菌酯合理比例混配能較好防控建蘭莖腐病的發(fā)生。姚錦愛等[14]開展建蘭莖腐病病原菌尖孢鐮刀菌生物學(xué)特性研究，發(fā)現(xiàn)不同地域或蘭科寄主植物上尖孢鐮刀菌的生物學(xué)特性存在一定差異，建蘭莖腐病病原菌尖孢鐮刀菌受溫度影響較明顯，35 ℃以上高溫和15 ℃以下低溫對病原菌生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)具有明顯抑制作用。【本研究切入點】本研究課題組前期對兜蘭種植基地病害的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，兜蘭萎蔫病是兜蘭生產(chǎn)中發(fā)生較嚴重的病害，而目前關(guān)于兜蘭萎蔫病的研究鮮見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】分析兜蘭萎蔫病發(fā)病原因和發(fā)病規(guī)律，并進行病原菌分離鑒定，明確其致病菌，為兜蘭萎蔫病的防控及兜蘭產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018年1月至2019年12月在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院進行。兜蘭萎蔫病病害樣本采集于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所觀賞植物研發(fā)推廣中心的帶葉兜蘭、同色兜蘭、紫紋兜蘭、卷萼兜蘭、亨利兜蘭和長瓣兜蘭發(fā)病植株。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌分離、培養(yǎng)與致病力測定 從溫室采集具有兜蘭萎蔫病典型癥狀的新鮮病葉，參考錢雙宏等[15]的常規(guī)組織分離法分離和培養(yǎng)病原菌。產(chǎn)孢后進行單孢純化，觀察形態(tài)特征并根據(jù)孢子形態(tài)進行鑒定。參考錢雙宏等[15]、江秀均等[16]的方法進行離體接種和活體接種培養(yǎng)，離體接種培養(yǎng)7 d后對比觀察離體葉片的發(fā)病癥狀和田間癥狀，活體接種培養(yǎng)15 d后對比觀察活體葉片的發(fā)病癥狀和田間癥狀，并從發(fā)病部位進行病原菌分離，觀察孢子的形態(tài)特征。

1.2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定和rDNA-ITS序列分子鑒定 參考錢雙宏等[15]的方法，待培養(yǎng)的病原菌產(chǎn)孢后進行單孢純化，并參照陸家云[17]的方法進行病原菌形態(tài)學(xué)鑒定。參照陳吉良等[18]的方法提取病原真菌DNA。引物為通用的真菌引物ITS1和ITS4。PCR反應(yīng)體系20 μl：2×TaqPCR Master Mix 10 μl，ITS1和ITS4各1 μl，DNA模板1 μl，ddH2O 7 μl。擴增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段，并進行連接轉(zhuǎn)化，選取陽性克隆送至生工生物工程(上海)有限公司進行測序，將測序結(jié)果在NCBI上進行BLAST在線同源比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 兜蘭萎蔫病病害的癥狀

選取葉片情況、根系情況、整株狀態(tài)和受感染力度4個指標對不同種類兜蘭萎蔫病發(fā)病情況進行統(tǒng)計，評價不同種類兜蘭受萎蔫病的影響程度。由表1可知，紫紋兜蘭、卷萼兜蘭和亨利兜蘭受萎蔫病影響較嚴重，其中，發(fā)病的紫紋兜蘭整株呈萎蔫狀，葉表皮出現(xiàn)環(huán)狀或帶狀的紫紅色病變，根莖也被侵染變?yōu)樽霞t色，病情較嚴重時，基部葉片變黃腐爛，根莖也發(fā)生深度腐爛，導(dǎo)致植株枯萎死亡；卷萼兜蘭和亨利兜蘭的發(fā)病情況與紫紋兜蘭相似，受感染葉片呈紫紅色環(huán)狀病變并擴展至整片葉片，同株其他葉片葉色變淺，呈嚴重失水狀態(tài)，后期葉從基部斷開，致使整株死亡；而帶葉兜蘭和同色兜蘭受萎蔫病影響較輕，葉片呈現(xiàn)病變后擴展，受感染葉片呈萎蔫狀，同株其他葉片受感染較輕，部分根系腐爛，其余根系尚好；長瓣兜蘭具有較大的肉質(zhì)葉片，受感染后葉片枯死，但其他葉片受影響較小，部分根系腐爛，整株狀態(tài)尚可。

表1 不同種類兜蘭萎蔫病的發(fā)病情況

2.2 病原菌的分離與培養(yǎng)

從兜蘭萎蔫病病斑中分離到3株病原菌，分別命名為WY-1、WY-2和WY-3。從圖1可看出，3株病原菌的菌落顏色存在明顯差異，其中，WY-1菌株整個菌落均呈純白色；WY-2菌株的菌落中間呈棕紅色，邊緣菌絲呈棕黃色，氣生菌絲較另外2株菌株發(fā)達；WY-3菌株的菌落中間呈灰色，邊緣菌絲呈白色。

2.3 病原菌的致病力測定

對分離到的3株菌株分別進行離體和活體接種，發(fā)現(xiàn)WY-1菌株和WY-3菌株均無發(fā)病癥狀產(chǎn)生，WY-2菌株接種后全部發(fā)病，因此，確定WY-2為引起兜蘭萎蔫病的主要病原菌株。用離體接種(圖2)和活體接種(圖3)2種方法將純化的WY-2菌株回接到健康兜蘭植株葉片上，離體接種約5 d后離體葉片開始發(fā)病，活體植株葉片接種約15 d后開始發(fā)病，活體接種和離體接種癥狀均與田間自然發(fā)病癥狀相同。從發(fā)病葉片上再分離得到的菌株在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性與純化菌株一致，鏡檢后觀察到相同形態(tài)特征的分生孢子，表明所分離到的WY-2菌株為兜蘭萎蔫病病原菌。

圖1 兜蘭萎蔫病病原菌的分離和培養(yǎng)結(jié)果

圖2 離體接種WY-2菌株的兜蘭葉片發(fā)病情況

圖3 活體接種WY-2菌株的兜蘭葉片發(fā)病情況

2.4 兜蘭萎蔫病病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

觀察發(fā)現(xiàn)，兜蘭萎蔫病病原菌的氣生菌絲生長茂盛，菌落初為棕紅色，隨著菌落的擴大，開始變?yōu)榧t色(圖4-A)，菌落正面顏色較淺，背面顏色較深。鏡檢觀察到病原菌菌絲發(fā)達，分枝繁茂(圖4-B)，小型分生孢子數(shù)量多，單胞，卵形、橢圓形或卵圓形；中型孢子(圖4-C)數(shù)量少，2～3分隔，多為2分隔，壁薄，鐮刀形，較均勻地向兩端逐漸收縮變尖，頂細胞稍呈鉤狀，孢子大小為31.4～46.8.2 μm×3.2～4.5 μm；大型孢子(圖4-D)3～5分隔，多為4分隔，壁薄，鐮刀形，較均勻地向兩端逐漸收縮變尖，頂細胞稍呈鉤狀，孢子大小為43.8～56.4 μm×3.2～5.0 μm。

2.5 兜蘭病原菌的rDNA-ITS序列分子鑒定

使用真菌通用引物ITS1/ITS4對致病性菌株的rDNA-ITS序列進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物(圖5)經(jīng)測序，目的片段長度572 bp，將測序結(jié)果在NCBI上進行BLAST同源性比對，結(jié)果該菌株與鐮刀孢屬尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)的相似性達99.0 %。

3 討 論

鐮孢菌屬(Fusarium)真菌是常見的蘭花病原真菌，常引起蘭花葉斑病、花斑病、枯萎病、假莖或根腐病等[19]。尖孢鐮刀菌隸屬于鐮孢菌屬，其引起的枯萎病是一種世界性分布的土傳維管束真菌病害，寄主范圍廣，可引起瓜類、茄科、香蕉、棉及花卉等100多種植物發(fā)生枯萎病，近年來蘭花萎蔫病在云南、廣東、廣西、福建、浙江和安徽等地均有不同程度發(fā)生[6]。兜蘭萎蔫病病原菌除危害兜蘭外，還危害蝴蝶蘭屬、蘭屬、卡特蘭屬、石斛屬和香莢蘭屬植物等[2]。本研究發(fā)現(xiàn)兜蘭萎蔫病病原菌屬于尖孢鐮刀菌，與徐波等[6]的研究結(jié)果一致。

病原菌致病力測定是病害病原菌鑒定的重要環(huán)節(jié)，通過致病力測定可排除一些非致病菌株，減少后期工作量。本研究致病力測定采用離體接種和活體植株接種兩種方法，其中，離體接種法具有操作簡便、接種發(fā)病時期短、鑒定病原菌較快捷等優(yōu)點，但由于離體接種脫離植物體，發(fā)病環(huán)境和條件有較大改變，會存在一定的測定誤差，因而目前更多采用活體接種法進行致病力測定。而活體接種也存在接種發(fā)病周期長、鑒定等待期較長等缺點。本研究在致病力測定方面同時采用兩種方法，測定結(jié)果準確可靠。

圖4 兜蘭萎蔫病病原菌的形態(tài)

M：DL2000 DNA Marker；1：陰性對照(ddH2O)；2：菌株P(guān)CR擴增產(chǎn)物

本研究結(jié)果表明，帶葉兜蘭、同色兜蘭、紫紋兜蘭、卷萼兜蘭、亨利兜蘭和長瓣兜蘭因?qū)傩圆町愝^大，其受萎蔫病的危害程度相差迥異。長瓣兜蘭為廣西分布的野生兜蘭物種，具有肉質(zhì)的葉片和強大的根系，在廣西遷地保護的適應(yīng)性較強[20]，受萎蔫病影響較小；帶葉兜蘭和同色兜蘭在廣西也具有較廣的分布區(qū)域，適應(yīng)性較強[21]，抗萎蔫病能力較強；紫紋兜蘭和卷萼兜蘭葉片較薄，根系相對較少，易受萎蔫病感染，感染后葉片顏色很快變淡、根系腐爛而致植株死亡。

已有研究表明，很多作物均會發(fā)生鐮刀菌引起的病害，但目前對蘭科植物鐮刀菌的研究主要集中在病原菌分離鑒定及藥劑篩選等方面[6-13]，對其致病機理的研究鮮有報道，這將是蘭科植物鐮刀菌后期研究的主要方向。此外，針對病原進行生物學(xué)防治，研發(fā)有效拮抗菌藥劑是主要途徑，且目前已有在蘭科植物應(yīng)用生物抗菌劑[14，21-22]及針對其病原菌進行分子生物學(xué)研究[23]的報道。

4 結(jié) 論

依據(jù)兜蘭萎蔫病病原菌的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特性，可確定其致病菌為尖孢鐮刀菌；同時采用離體接種和活體植株接種法測定兜蘭萎蔫病病原菌致病力具有較高的可靠性。