不同產量八角林土壤的生物學性狀與細菌多樣性特征

肖 健，任奎瑜，伍思宇，梁文匯*，楊尚東*

(1.廣西大學農學院，廣西 南寧 530004；2.廣西林業科學研究院/廣西特色經濟林培育與利用重點實驗室/國家林業和草原局八角肉桂工程技術研究中心/廣西木本香料工程技術研究中心，廣西 南寧 530002)

【研究意義】八角(IlliciumverumHook.f)又稱大茴香，俗稱大料，是八角茴香科(Illiciaceae)八角屬(IlliciumLinn.)常綠闊葉喬木，原產于我國西南地區和越南等地的亞熱帶地區，以果入藥具有溫中開胃及祛寒等療效[1-2]，其果皮、種子、葉片、枝梢和果實均含有豐富的茴香油[3]，在工業上主要用于提煉大茴香[4]，并進一步合成大茴香醇和大茴香醛等系列香料，用于食品、醫藥、啤酒、香皂和香水等產業。八角茴香油對細菌和真菌均具有一定的抗菌作用和抗氧化活性[5-6]，可用于提煉莽草酸制造抗禽流感藥物達菲[7]。廣西既是八角的原產地也是主產區，有世界八角之鄉的美稱，但現階段廣西的大部分八角林管理粗放，導致八角產量大小年現象突出，產量和品質波動大，嚴重阻礙了廣西八角產業的可持續發展。土壤生物學性狀及細菌多樣性特征可用于指示土壤的健康和肥力狀況[8]，但目前對低產八角林與其根際土壤生物學性狀及細菌多樣性是否存在某種關聯，以及低產八角林根際微生物是否誘導八角林產量差異的了解甚少。因此，分析不同產量八角林土壤生物學性狀及細菌的多樣性特征，對改良低產八角林土壤生態環境，構建穩定、高產的八角林栽培管理技術體系具有重要意義。【前人研究進展】廣西林業科學研究院通過多年研究發現，適宜八角生長的土壤pH為4.5～6.5，土壤施用、葉面噴施稀土和硼砂均能不同程度提高八角產量和促進林木生長[9]。已有研究發現，八角喜酸性土壤環境，適宜土壤pH為4.5～5.5，對土壤養分的要求為：有機質2.0 %，速效氮100 mg/kg，速效磷30 mg/kg，速效鉀90 mg/kg[10]。也有相關研究提出了我國八角產業的優勢區域布局[11]。袁霞和何斌[12]調查發現，土壤酶活性可作為評價八角林地土壤肥力的指標之一，提高土壤酶活性和增加土壤生物學肥力對提高八角林地土壤有機質含量和有效養分供應水平均具有重要作用。已有研究表明，土壤微生物與其他作物的增產有一定相關性，如王帥帥等[13]研究發現，不同防除雜草模式能通過改善土壤細菌占比來提高大蔥產量和改善大蔥根際土壤的健康狀況；趙亞麗等[14]研究顯示，土壤微生物量和酶活性可通過影響土壤肥力來影響作物產量。【本研究切入點】廣西八角栽培中存在盲目施肥、缺乏規范化管理及生產出的八角品質參差不齊和產量不穩定等現象，急需通過系統研究八角林土壤的生態系統來提高八角產量和品質，但目前關于影響八角林土壤健康及土壤肥力持續平衡供給狀況的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】以高產和低產八角林為研究對象，分析其土壤生物學性狀和細菌多樣性特征，從土壤健康和肥力狀況角度系統地探究影響八角產量的土壤因素，為廣西八角林的優質、穩產和高產栽培提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 采樣地概況

采樣點廣西梧州市藤縣古龍鎮合隆村位于東經110°52′02″、北緯23°37′21″，屬亞熱帶季風氣候，年均氣溫21 ℃，日照1721.90 h，年均≥10 ℃活動積溫7471.3 ℃，適宜種植八角。土壤類型為砂頁巖母質發育而成的赤紅壤，pH 5.6，全氮含量0.60 g/kg，全磷含量0.48 g/kg，全鉀含量14.40 g/kg，速效磷含量5.00 mg/kg，速效鉀含量50.00 mg/kg。

1.2 樣品采集與處理

2019年7月28日采集高產八角林(品種為柔枝紅花八角，14年生，產量17 010 kg/hm2)和低產八角林(品種為柔枝紅花八角，14年生，產量8370 kg/hm2)0～30 cm土層的土壤樣品，每種類型八角林土壤隨機選擇6個取樣點，用無菌袋收集后裝入放有冰袋的冰盒中帶回實驗室，將每份土壤樣品分為兩部分，一部分在室內風干后過40目篩，用于土壤理化性質測定，另一部分過10目篩后，分別用于土壤生物學性狀和細菌群落結構分析。

1.3 土壤生物學性狀分析

土壤碳、氮和磷循環相關酶β-葡糖苷酶活性采用Hayano和Koichi[15]的方法進行測定；氨肽酶活性參考Ladd[16]的方法進行測定；磷酸酶活性參考Tabatabai和Bremner[17]的方法進行測定。土壤微生物生物量碳、氮和磷含量分別采用氯仿熏蒸提取—容量分析法[18]、茚三酮比色法[19]和磷鉬藍比色法[20]測定。

1.4 土壤細菌多樣性分析

土壤細菌多樣性分析由上海美吉生物醫藥科技有限公司測序完成。具體測序流程：參照FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒(MP Biomedicals，U. S.)說明進行總DNA抽提，使用NanoDrop2000檢測DNA濃度和純度，用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量；用338F和806R引物對V3～V4可變區進行PCR擴增。Illumina Miseq測序：回收PCR產物(2 %瓊脂糖凝膠檢測)→純化(Extraction Kit)→Tris-HCl洗脫→電泳檢測→檢測定量(QuantiFluorTM-ST)→構建PE2×300文庫。其中，構建文庫步驟為：①連接“Y”字形連接器；②用磁珠過濾，自連接片段；③通過PCR擴增文庫模板；④氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段。利用Illumina Miseq測序公司MiseqPE300平臺進行測序，原始數據上傳至NCBI數據庫進行在線比對。本研究選用Ace指數、Chao指數、Simpson指數和Shannon指數分析不同產量八角林的土壤細菌多樣性。參考Chao等[21]的方法計算Chao指數，參考Grice等[22]的方法計算Ace指數和Shannon指數：參考Simpson[23]的方法計算Simpson指數， Chao1、Ace和Shannon指數越大，Simpson指數越小，說明樣品的物種豐富度和多樣性越高。

1.5 統計分析

試驗數據采用Excel 2019和SPSS 21.0進行統計，并以上海美吉生物醫藥科技有限公司的I-sanger云數據分析平臺進行在線分析。

2 結果與分析

2.1 不同產量八角林的根際土壤生物學性狀特征

2.1.1 土壤酶活性特征 由表1可知，低產八角林土壤的β-葡糖苷酶活性雖然高于高產八角林，但二者間差異不顯著(P>0.05，下同)；磷酸酶活性低于高產林土壤，但二者間差異不顯著；氨肽酶活性顯著高于高產八角林土壤14.4 %。說明低低產八角林土壤中存在較高產八角林土壤更活躍的氮素循環過程，其更高活性的氨肽酶活性可能會導致低產八角林土壤中持續的氮素供給能力遜于高產八角林土壤的現象。

2.1.2 土壤微生物生物量碳、氮和磷含量 土壤微生物生物量及其變化情況是表征土壤肥力及其變化情況的重要依據之一。由表2可知，高產八角林土壤的微生物生物量碳、氮和磷含量均高于低產八角林，分別為低產八角林的1.64、1.73和1.23倍。其中，高產八角林土壤的微生物生物量氮含量明顯高于低產八角林，微生物生物量碳和磷含量均顯著高于低產八角林。表明高產八角林土壤肥力比低產八角林更高，且是八角產量更高的重要保障。

2.2 不同產量八角林的根際土壤細菌多樣性分析

2.2.1 Alpha多樣性 由表3可知，基于高通量測序技術分析，八角林土壤樣品中的細菌群落隸屬于28門74綱185目317科565屬1162種3981 OTU。其中，高產八角林土壤的細菌群落隸屬于27門70綱177目304科538屬1080種3366 OTU，低產八角林土壤的細菌群落隸屬于27門71綱174目294科520屬1047種3460 OTU。說明高產八角林土壤細菌的豐富度大于低產八角林。

2.2.2 豐富度和多樣性 基于I-sanger云分析平臺，計算出不同產量八角林土壤細菌的豐富度、多樣性指數和覆蓋率。以Chao1和Ace指數指示細菌的豐富度，Shannon和Simpson指數指示細菌的多樣性，Coverage指數指示細菌的覆蓋率。由表4可知，高產八角林土壤中指示細菌豐富度的Ace和Chao1指數高于低產八角林，但二者間差異不顯著；高產八角林土壤中指示細菌多樣性的Shannon指數顯著高于低產八角林，而Simpson指高于低產八角林，但二者間無顯著差異。表明八角林的土壤細菌豐富度對八角產量的影響可能遜于細菌多樣性的影響，更豐富的細菌多樣性可能是高產八角林產出更高產量的重要原因之一。

表1 不同產量八角林的土壤酶活性比較

表2 不同八角林的根際土壤微生物生物量比較

表3 不同產量八角林根際土壤樣品的物種豐富度統計結果

表4 不同產量八角林的土壤細菌豐富度和多樣性指數比較

2.3 群落組成分析結果

2.3.1 門分類水平的優勢菌群分析 從圖1-A和圖1-B可看出，在門分類水平上，高產和低產八角林土壤的優勢細菌門分別有10和11個。其中，高產八角林土壤的優勢細菌在門分類水平上占比排序為變形桿菌門(Proteobacteria，36.06 %)>放線菌門(Actinobacteria，21.80 %)>酸桿菌門(Acidobacteria，16.67 %)>綠彎菌門(Chloroflexi，10.29 %)>浮霉菌門(Planctomycetes，3.44 %)>疣微菌門(Verrucomicrobia，3.10 %)>擬桿菌門(Bacteroidetes，1.95 %)>WPS-2(1.90 %)>芽單胞菌門(Gemmatimonadetes，1.60 %)，其他門(others)占3.20 %(圖1-A)；低產八角林土壤的優勢細菌在門分類水平上占比排序為變形桿菌門(Proteobacteria，31.23 %)>放線菌門(Actinobacteria，21.52 %)>綠彎菌門(Chloroflexi，15.99 %)>酸桿菌門(Acidobacteria，15.22 %)>浮霉菌門(Planctomycetes，3.44 %)>疣微菌門(Verrucomicrobia，2.71 %)>WPS-2(2.47 %)>Patescibacteria(1.47 %)>芽單胞菌門(Gemmatimonadetes，1.37 %)>厚壁菌門(Firmicutes，1.34 %)=擬桿菌門(Bacteroidetes，1.34 %)，其他門(others)占1.89 %(圖1-B)。可見，高產和低產八角林土壤的優勢細菌在門分類水平上占比存在明顯差異，主要表現在低產八角林土壤優勢細菌在門分類水平上的變形桿菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和其他門細菌占比分別較高產八角林土壤下降4.83 %、1.45 %、0.61 %和1.31 %(絕對值，下同)，而綠彎菌門(Chloroflexi)細菌占比急劇上升至15.99 %，較高產八角林土壤提高5.70 %；同時，Patescibacteria門和厚壁菌門(Firmicutes)細菌亦由高產八角林土壤中的非優勢細菌門，轉變成低產八角林土壤中的優勢細菌門。由此推測，低產八角林土壤中優勢細菌在門分類水平上占比及排序的變化，尤其是其他門細菌占比的下降，可能是低產八角林土壤細菌多樣性下降的重要原因。

2.3.2 屬分類水平的優勢菌群分析 在屬分類水平上，高產八角林土壤的優勢細菌占比排序為未分類紗麗桿菌科(norank_f__Xanthobacteraceae，9.41 %)>嗜酸棲熱菌屬(Acidothermus，8.29 %)>norank_o__Elsterales(3.88 %)>norank_o__Subgroup_2(3.87 %)>norank_f__JG30-KF-AS9(3.66 %)>未分類酸桿菌屬(norank_o__Acidobacteriales，3.31 %)>norank_c__AD3(3.23 %)>Candidatus_solibacter(2.98 %)>norank_p__WPS-2(2.47 %)>norank_o__IMCC26256(2.41 %)>慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium，2.38 %)>不動桿菌屬(Acidibacter，2.19 %)>norank_f__Gemmataceae(2.17 %)>Conexibacter(1.94 %)>未分類放線菌屬(norank_c__Actinobacteria，1.74 %)=HSB_OF53_F07(1.74 %)>norank_c_TK10 (1.31 %)>FCPS473(1.27 %)，其他屬(others)占比36.04 %(2-A)；低產八角林土壤的優勢細菌占比排序為未分類紗麗桿菌科(norank_f__Xanthobacteraceae，11.67 %)>嗜酸棲熱菌屬(Acidothermus，6.53 %)>norank_o__Elsterales(4.04 %)>Candidatus_solibacter(3.71 %)>norank_o__Subgroup_2(3.59 %)>慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium，3.14 %)>未分類酸桿菌屬(norank_o__Acidobacteriales，2.87 %)>norank_o__IMCC26256(2.75 %)>norank_f__JG30-KF-AS9(2.74 %)>norank_f__Gemmataceae(2.32 %)>不動桿菌屬(Acidibacter，2.00 %)>Conexibacter(1.98 %)>norank_p__WPS-2(1.90 %)>未分類放線菌屬(norank_c__Actinobacteria，1.84 %)>norank_o__Gaiellales(1.72 %)>norank_f__67_14(1.65 %)>Candidatus_Xiphinematobacter(1.57 %)，其他屬(others)占比35.74 %(圖2-B)。可見，與高產八角林土壤相比，低產八角林土壤的優勢細菌在屬分類水平上占比發生了明顯變化，其中除排序前3位的優勢細菌未發生變化外，高產林土壤中優勢細菌占比排第4位的屬由原來的norank_o__subgroup_2變成低產八角林土壤中的Candidatus_Solibacter；低產八角林土壤的部分優勢細菌屬缺失，如norank_c__AD3(3.23 %)、HSB_OF53_F07(1.74 %)、norank_c_TK10(1.31 %)和FCPS473(1.27 %)等，以及其他屬(others)細菌占比下降。由此推測，優勢細菌群落結構發生變化和細菌多樣性下降可能是低產八角林產量低的原因之一。

圖1 高產八角林土壤(A)和低產八角林土壤(B)在門分類水平上的細菌組成

圖2 高產八角林土壤(A)和低產八角林土壤(B)在屬分類水平上的細菌組成

圖3 高產八角林土壤和低產八角林土壤細菌的屬分類水平(A)和種分類水平(B)Venn圖

此外，由屬分類水平及種分類水平Venn圖可看出，在屬分類水平(圖3-A)上，高產和低產八角林土壤的共有細菌屬為490個，在低產八角林土壤中特有的細菌屬為30個，而高產八角林土壤中特有的細菌屬為48個；在種分類水平(圖3-B)上，高產和低產八角林土壤的共有細菌種為962個，低產八角林土壤中特有的細菌種為85個，而高產八角林土壤中特有的細菌種達118個。由此推測，土壤中更豐富的細菌種和屬分類水平，亦可能是高產八角林產量高于低產八角林的原因之一。

3 討 論

種植八角是我國南方山區群眾經濟收入的主要來源和脫貧致富的有效途徑[13]。廣西八角栽培面積和產量占全國的90 %以上，其中，廣西藤縣種植八角歷史悠久，近年來雖已加強管理和注重新技術引進與應用，但由于樹齡老化或環境惡化等原因仍出現八角產量下降、品質劣化等不良現象[14,24]。已有研究證實，土壤酶參與土壤中幾乎所有營養元素的循環[25]，其活性不僅能指示土壤生態系統功能變化的多樣性和穩定性[26]，亦是評價土壤健康和肥力水平的重要指標[27]。本研究發現，低產八角林土壤的β-葡糖苷酶和氨肽酶活性雖然高于高產八角林，但僅氨肽酶活性顯著高于后者，且土壤磷酸酶活性無顯著差異。由此推測，低產八角林土壤中部分氮素循環雖然強于高產八角林，但作為氮源生物學性狀指標的微生物生物量氮含量差異不顯著，表明低產八角林土壤與高產八角林土壤相比，極可能會出現持續供氮能力不足現象。土壤微生物生物量同樣是衡量土壤質量、維持土壤肥力和作物生產力的一個重要指標[28]。土壤中微生物生物量越大，土壤通過有機養分礦化提供給植物所需養分的能力就越強[29]。其中，土壤微生物生物量碳不僅可促進土壤形成活性較高的新生腐殖質，而且還可在土壤全碳含量變化前反映土壤的微小變化[30]；土壤微生物生物量氮能反映土壤氮素的有效性，在土壤氮的供應和循環中發揮重要作用[30]；土壤微生物生物量磷可反映土壤磷素的供應水平[31]。此外，微生物生物量磷雖然不能被植物直接吸收利用，但能緩慢釋放無機磷，因此一直被認為是土壤中的有效磷來源，對于植物生長非常重要[32]。本研究中，低產八角林土壤中微生物生物量碳和磷含量均顯著低于高產八角林，但二者的土壤微生物生物量氮間無顯著差異。由此推斷，低產八角林土壤的有機碳含量較低、持續供給養分能力遜于高產八角林，尤其是土壤磷素持續供應能力不足可能是其低產的重要原因之一。

已有研究證實，土壤微生物群落結構越豐富、物種越均勻及多樣性越豐富，植物對抗病原菌的綜合能力就越強[33-34]。本研究基于高通量測序技術分析發現，低產八角林土壤的細菌豐富度雖然與高產八角林無顯著差異，但Shannon指數顯著低于后者，由此推測，低產八角林土壤中顯著貧乏的細菌多樣性可能導致其土壤生態系統功能降低、養分供給平衡紊亂等影響產量的障礙因素發生概率升高，從而出現產量不高現象；基于門分類水平分析發現，與高產八角林土壤相比，低產八角林土壤的變形桿菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和其他門細菌占比下降，綠彎菌門(Chloroflexi)細菌、Patescibacteria門和厚壁菌門(Firmicutes)細菌占比急劇上升。其中，群落組成占比急劇上升的綠彎菌門細菌是一個新的系統發育分支，雖然其在環境中普遍存在，但主要生活在深海、湖泊及淹水的泥灘等厭氧環境[35-36]，尤其是高氮低碳環境更有利于其生存和大量繁殖[37]；厚壁菌門細菌是一個大類細菌，可降解多種有機污染物，如多氯聯苯和石油烴等，且其在貧瘠土壤中豐度更大[38]。由此推測，氮的非均衡供應及碳、磷供給不足，可能均是導致低產八角林產量不高的重要原因；基于屬分類水平分析發現，與高產八角林土壤相比，低產八角林土壤的優勢細菌占比同樣發生明顯變化，尤其是Candidatussolibacter屬細菌占比上升，部分優勢細菌屬缺失及其他屬(other)細菌占比下降，細菌群落與功能多樣性降低，也是低產八角林產量不高的重要原因。

4 結 論

與高產八角林相比，低產八角林土壤中氮的非均衡供應、碳和磷儲備偏低，以及細菌多樣性下降，部分優勢細菌屬缺失導致的細菌群落結構失衡，均可能是低產八角林八角低產量的重要原因。