塔克拉瑪干沙塵暴源區空氣可培養細菌多樣性

夏庫拉·巴克特亞爾，林 青，劉珍珠，楊紅梅，婁 愷*

(1.新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆農業科學院微生物應用研究所，新疆 烏魯木齊 830091)

【研究意義】沙塵暴是干旱及半干旱地區頻繁發生的一種典型的災害性天氣[1]。塔克拉瑪干沙漠作為亞洲沙塵暴事件的主要來源之一，在發生沙塵暴期間，能攜帶沙塵向東吹至日本，穿過太平洋抵達美國，對全球生態系統和氣候變化有重要影響[2]。沙塵粒子中攜帶大量的生物氣溶膠，包括細菌、病毒、真菌及孢子，且生物氣溶膠可以產生和傳播過敏原與毒素，從而增加人們患心血管疾病、呼吸道疾病、癌癥和其他疾病的風險[3-7]。生物氣溶膠隨著沙塵暴可以長距離運輸并且可以在大氣層中維持幾個小時甚至幾天，對下風向地區的生態系統、農業、交通、經濟發展造成了嚴重的影響[8-10]。【前人研究進展】Attiya等利用衛星檢測對伊拉克地區1980-2015年間的沙塵氣溶膠指數進行了研究，發現沙塵氣溶膠濃度對空氣質量變化有重要的影響[11]。Griffin等[12]采用可培養方法對受非洲沙塵暴影響的加勒比海區域空氣微生物進行了研究，發現在有沙塵天氣和沒有沙塵天氣中可培養空氣微生物的多樣性發生了變化。Goudarzi等[13]對伊朗沙塵暴期間細菌特征和可吸入顆粒物進行了研究，指出可吸入顆粒物和空氣細菌濃度之間有密切的聯系。LI Jingxin等[14]對塔克拉瑪干沙漠南緣的和田地區空氣污染事件進行了研究，結果表明，在發生沙塵暴時可吸入顆粒PM10的含量明顯上升。李鴻濤等[15]在沙塵天氣對生物氣溶膠中總微生物濃度及粒徑分布的影響研究中指出，沙塵發生時，生物氣溶膠中總微生物濃度顯著增加，微生物的粒徑分布發生明顯變化。李婉欣等[16]對西安市秋冬季不同空氣質量下可培養微生物氣溶膠濃度和粒徑分布發現，隨著空氣污染等級增加，細菌氣溶膠粒徑分布向粗顆粒遷移且環境因子對微生物氣溶膠的影響不同。目前國內對空氣微生物的研究多見于城市生態系統、垃圾場、醫院、旅游景點等與人類生產活動相關的區域[17-20]，而對高溫、干旱的極端環境空氣微生物的研究鮮有報道。【本研究切入點】因此，本研究以塔克拉瑪干沙塵暴源區(尉犁、若羌、且末、民豐、于田、策勒、G217國道、沙雅和庫車地區)為研究對象，對上述9個地區的空氣可培養細菌進行分離純化，及16SrRNA基因序列分析。【擬解決的關鍵問題】探討沙塵暴發生前期、中期、后期空氣可培養細菌的群落組成情況，并結合環境因子信息，闡述環境因子對空氣細菌多樣性的影響，為開發極端微生物資源和沙塵暴災害預警工作提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究區域簡介 塔克拉瑪干沙漠位于新疆塔里木盆地中心，是我國面積最大的沙漠，也是世界上第十大沙漠和世界第二大流動沙漠。整個沙漠東西約1130 km,南北寬約600 km，面積33.76 km2。塔克拉瑪干沙漠地處亞歐大陸，氣候干旱，且塔克拉瑪干沙漠地表有極其豐富的流沙，在特定閉塞地理環境中，風沙災害頻繁，每年春夏兩季，沙漠周圍及腹地沙塵天氣平均多達90 d,各種強度的沙塵暴發生期通常跨越整個春夏季節[22-23]。

1.1.2 培養基 R2A培養基[24]：酵母提取物0.5 g、蛋白胨0.5 g、酪蛋白氨基酸0.5 g、葡萄糖0.5 g、可溶性淀粉0.5 g、K2HPO40.3 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、丙酮酸鈉0.3 g、瓊脂15.0 g溶解于1 L的蒸餾水，pH調至7.2。

1.1.3 引物序列 細菌通用引物[25]27F (3′-GACTCGGTCCTAGTTTGAGA-5′)和1492R (3′-ACGCCGTAGTGGTAGGAATT-5′)由新疆昆泰瑞測序公司合成。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 本研究于2018年4月12日-21日在尉犁、若羌、且末、民豐、于田、策勒、G217國道、沙雅和庫車9個地區中的12個位點開展采樣工作(圖1)，全程3964 km。距地面1.5 m，將R2A平板置于手持式空氣采樣器中，設置空氣流量為50 L/min,采樣時間為3 min，每個時期設置4個平行樣，裝入無菌采樣袋中，置于裝有冰袋的泡沫箱內帶回實驗室進行培養。

1.2.2 菌株的分離、純化與保藏 根據菌落形態、大小、顏色等特征挑取單菌落在R2A固體培養基中分離純化4次獲得純菌，純化后的菌株接種于斜面，用15 %甘油保種液洗脫菌苔，-80 ℃保藏。

1.2.3 分子生物學鑒定與系統發育分析 采用DNA提取試劑盒，按說明書提取菌株基因組DNA，使用細菌通用引物27F和1492R對細菌16S RNA基因進行PCR擴增。PCR反應體系(50 μl)：TaqDNA Premix 25 μl，上下引物(10 μmol/L)各0.5 μl，基因組DNA 0.5 μl，ddH2O 24 μl。PCR反應條件:95 ℃預變性5 min; 95 ℃變性40 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min ，32個循環；72 ℃總延伸10 min。用0.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，將合格的PCR產物送至新疆昆泰銳測序公司進行雙向測序。利用Chromas軟件分析測序所得的16S RNA基因序列，去除低質量的測序堿基后得到的序列有效長度約為1500 bp。將有效序列提交至EZbiocloud(https://www.ezbiocloud.net/)數據進行BLAST分析，以16SrRNA基因序列相似性大于等于97 %作為同種菌株的劃分標準。下載與目的序列最相近的菌株16S rRNA基因序列，通過MEGA7.0軟件中的Kimura2-parameter model 模型計算進化距離，采用領接法(Neighbor-Joining)構建系統進化樹，Bootstrap設為1000次。

圖1 采樣點地理分布

1.2.4 環境因子關聯分析 典范對應分析是結合采樣地環境因子信息，闡述環境因子對沙塵暴空氣細菌群落多樣性的影響。空氣中細菌群落結構與各環境因子間關系利用CANOCO軟件中的典型對應分析進行運算輸出。

1.2.5 物種多樣性分析 定義16S rRNA基因序列相似性大于等于97 %作為同一種的歸類原則。對塔克拉瑪干沙塵暴源區的空氣細菌進行多樣性分析，計算多樣性指數，比較不同地區沙塵暴前、中、后期的物種多樣性組成差異。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離純化、保藏

從R2A培養基上根據菌落的大小、顏色等形態特征的不同，共分離出144株空氣細菌，純化后-80 ℃保藏。提取菌株基因組DNA，PCR擴增16S rRNA基因后進行電泳檢測，均能得到長度為1500 bp的單一條帶。獲得的16S rRNA基因序列GenBank登錄號為MK6226-MK789758。

2.2 可培養細菌的多樣性統計

從塔克拉瑪干沙塵暴源區空氣中共分離出144株細菌，經16S rRNA基因測序及序列比對。結果顯示，144株細菌隸屬于4個門32個屬76個種,分別為放線菌門(Actinobacteria，41.67 %)、變形菌門(Proteobacteria,10.42 %)、厚壁菌門(Firmicutes,46.53 %)、擬桿菌門(Bacteroidetes，1.4 %)。沙塵暴前期有12個屬，其中優勢屬為芽孢桿菌屬(Bacillus,11.11 %)、節桿菌屬(Arthrobacter，4.9 %)；沙塵暴中期有18個屬，其中優勢屬為芽孢桿菌屬(Bacillus,18.75 %)、馬西莉亞屬(Massilia，2.1 %)；沙塵暴后期有19個屬，其中優勢屬為芽孢桿菌屬(Bacillus,9.7 %)、短桿菌屬(Brevibacterium，2.8 %)；沙塵暴前期、中期、后期共有的優勢屬為芽孢桿菌屬，占分離細菌總數的38.89 %。在若羌1號采樣點、且末1號采樣點、庫車地區、沙雅地區采集到了沙塵暴前期樣品。在若羌2號采樣點、且末2號采樣點、民豐地區于田地區采集沙塵暴中期樣品。在尉犁地區、策勒地區、G217國道、且末3號采樣點采集沙塵暴后期樣品。

在屬水平上，細菌的多樣性隨沙塵暴不同時期變化明顯。如圖2所示，在沙塵暴前期，芽孢桿菌屬(Bacillus)和節桿菌屬(Arthrobacter)為優勢屬。其中，在若羌1號采樣點優勢屬為芽球菌屬；在且末2號采樣點優勢屬為馬西莉亞屬(Massilia)；在沙雅地區優勢屬為芽孢桿菌屬(Bacillus)和節桿菌屬(Arthrobacter)，在庫車地區優勢屬為芽孢桿菌(Bacillus)。

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不同顏色代表不同空氣細菌，柱高代表該屬所占比

圖3 沙塵暴中期可培養空氣細菌組成

如圖3所示，在沙塵暴中期，芽孢桿菌屬(Bacillus)和馬西莉亞屬(Massilia)為優勢屬。其中，在若羌2號采樣點優勢屬為葡萄球菌屬和芽球菌屬(Blastococcus)；在且末2號采樣點優勢屬為芽孢桿菌屬(Bacillus)；在民豐地區優勢屬為芽孢桿菌屬(Bacillus)和馬西莉亞屬(Massilia)；在于田地區優勢屬為芽孢桿菌屬(Bacillus)。

如圖4所示，在沙塵暴后期，芽孢桿菌屬(Bacillus)和短桿菌屬(Brevibacterium)為優勢屬。其中，且末3號采樣點優勢屬為芽孢桿菌屬(Bacillus)、考克氏菌屬(Kocuria)等；策勒地區優勢屬為芽孢桿菌屬(Bacillus)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)；G217國道優勢屬為芽孢桿菌屬；尉犁地區優勢屬為微桿菌屬(Microbacterium)和短桿菌屬(Brevibacterium)。由此可知，沙塵暴不同時期不同地點的空氣細菌呈現多樣性變化。

圖4 沙塵暴后期可培養空氣細菌組成

從每個種中選擇1株代表菌種與同源性相近的典型菌株(表1)進行比較，2個種與已知菌的16S rRNA基因序列相似性達到100 %,72個種已知菌的16S rRNA基因序列相似性達到97.56 %～99.93 %,1個種與已知菌的16S rRNA基因序列相似性達93.97 %，可能為潛在的新種。

表1 塔克拉瑪干沙塵暴源區代表菌株EZbiocloud比對結果

續表1 Continued table 1

續表1 Continued table 1

2.3 可培養細菌系統進化分析

選擇有代表性的31株菌，利用MEGA7.0構建系統發育樹(圖5)。通過系統發育樹，可以看出可培養菌株聚類于放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)。其中，放線菌門中分離獲得21個屬，60株；厚壁菌門中分離獲得5個屬，67株；變形菌門中獲得5個屬，15株；擬桿菌門中獲得1個屬，2株。S17與相似菌株獨立聚為一類，且與已知菌的16S rRNA基因序列相似性為93.97 %，可能為潛在的新種，這有待于進一步確定。

2.4 環境因子關聯分析

不同地區因地理環境因子而呈現出微生物的多樣性和特殊性。結合采樣點環境因子信息，分析環境因子對沙塵暴空氣細菌群落多樣性的影響(圖6)。通過屬和環境因子之間的CCA分析，不同環境因子對塔克拉瑪干沙塵暴源區空氣細菌多樣性的影響大小為：溫度>氣壓>海拔>風速>濕度。排序圖中，前2個排序軸的特征值分別為0.523和0.347，環境因子軸與樣點排序軸之間的相關系數分別為0.920和0.963。風速、濕度、海拔與沙塵暴空氣細菌群落多樣性呈正相關，氣壓和溫度與沙塵暴空氣細菌群落多樣性呈負相關。

2.5 可培養細菌多樣性指數分析

辛普森指數和香農指數用來估算樣品中微生物多樣性指數(表2)，其中Shannon值越大，說明群落多樣性越高，而辛普森指數則相反。策勒地區后期沙塵暴空氣可培養細菌的物種多樣性和豐富度最高，若羌1號采樣點沙塵暴空氣可培養細菌的物種多樣性和豐富度最低。整體上看，沙塵暴不同時期可培養空氣細菌群落結構組成的多樣性和豐富度大小水平為：后期>中期>前期。

圖5 基于16S rRNA基因構建的空氣細菌系統發育樹

△代表沙塵暴前期；□代表沙塵暴中期；○沙塵暴代表后期

3 討 論

本研究通過可培養方法對塔克拉瑪干沙塵暴源區的12樣點不同時期空氣微生物進行研究，經16S rRNA基因序列與EZbiocloud數據庫進行序列比對發現，可培養菌株屬于厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌(Bacteroidetes)下32屬的類群，其優勢屬為厚壁菌門中的芽孢桿菌屬(38.89 %)，這與本實驗室前人研究結果基本一致[26-28]。這是由于一些芽孢桿菌可以產生孢子來保護細菌，使它在強輻射、寡營養、極其干燥的環境中生存下來。沙塵暴中傳輸的微生物大多屬于厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、擬桿菌門類群，如芽孢桿菌屬、微桿菌屬、葡萄球菌屬、諾卡氏菌屬、紅球菌屬、節桿菌屬、短桿菌屬、庫克氏菌屬、副球菌屬、馬西莉亞屬、土壤球菌屬等，與本研究結果基本一致[29-34]。有報道指出庫克氏菌可引起呼吸道感染、消化道感染、皮膚軟組織感染、血流感染等人體所有組織系統感染，須引起臨床醫生和微生物檢驗人員的高度重視[35]。葡萄球菌菌屬多數為條件致病菌，具有潛在的公共衛生隱患[36]。

本研究發現，S17號(93.97 %)菌株可能為潛在的新種。這一結果表明，沙塵暴這種極端的環境中，由于菌種的適應性機制而獲得新種的可能性較大，因此在后續的實驗中，對篩選菌種的培養基進行優化，為獲得更多的新種奠定實驗基礎。極端環境大大提高了發現新種的可能性，很多研究指出極端環境是開發微生物資源的天然實驗室。賀瑞含等[37]

表2 采樣點不同時期空氣細菌多樣性指數

在北極苔原中可培養細菌的分離及其抗菌活性性測定中推測有22株細菌菌株為潛在新種；李曉亮等[38]在第六次北極科學考察海洋沉積物可培養細菌的多樣性分析中發現6中潛在的新種；張萬芹等[39]在貴州興義喀斯特洞穴土可培養細菌多樣性及其產蛋白酶、淀粉酶活性篩選發現至少有4種菌為潛在的新分類單元。王寧等[40]在比什凱克鹽堿土壤可培養細菌的多樣性報道部分菌株的16S rRNA基因序列同源性低于97 %，可能為潛在的新種。上述研究中獲得新種都基于傳統的分離純化技術，從側面反映可培養方法是微生物學研究中不可或缺的一部分。

環境因子對空氣微生物的多樣性、豐度、群落組成有重要的影響，這是由于不同環境中所生存的微生物不同。本研究結合環境因子(溫度、濕度、海拔、風速、氣壓)闡述環境因子對沙塵暴源區不同時期空氣微生物的影響。典范對應分析結果表明，不同環境因子對塔克拉瑪干沙塵暴源區空氣細菌多樣性的影響大小為：溫度>氣壓>海拔>風速>濕度。不同樣點在沙塵暴的不同時期空氣細菌群落多樣性和物種組成存在差異，由此表明環境因子對空氣細菌群落多樣性和物種組成的影響不可忽視。段育龍等[41]在天梯山石窟壁畫保存環境中空氣細菌的季節性變化中指出相對濕度、溫度及降雨等環境因子均對空氣細菌群落產生影響。通過了解不同微生物所受的環境因子的不同，可以在后續研究中更好的把握微生物培養的條件。

塔克拉瑪干沙塵暴源區存在豐富的空氣微生物資源，但由于采樣的特殊性和培養方法的局限性，本研究獲得的菌株可能是沙塵暴空氣微生物資源的冰山一角。因此在以后的研究中通過結合高通量測序、衛星數據軌道分析來獲得更加準確、更加全面、更加深入的有關空氣微生物數據[42-45]，為開發微生物資源、沙塵暴預警工作和荒漠化治理奠定理論基礎。

4 結 論

(1)從塔克拉瑪干沙塵暴源區空氣中共分離出144株細菌，經16S rRNA基因測序及序列比對顯示，144株細菌隸屬于4個門32個屬76個種,分別為放線菌門(Actinobacteria，41.67%)、變形菌門(Proteobacteria,10.42%)、厚壁菌門(Firmicutes,46.53%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，1.4%)。塔克拉瑪干沙塵暴源區12個采樣點可培養空氣細菌在沙塵暴前期有12個屬，中期有18個屬，后期有19個屬。

(2)通過屬和環境因子之間的CCA分析，不同環境因子對塔克拉瑪干沙塵暴源區空氣細菌多樣性的影響大小為溫度>氣壓>海拔>風速>濕度。

(3)沙塵暴不同時期空氣可培養細菌群落組成結構的多樣性和豐富度大小水平為后期>中期>前期。