?辣椒疫霉病拮抗菌LRS-1固體發酵條件優化及其抑菌穩定性研究

張亮 張周 譚麗 盛浩 袁紅 鄧立平

摘 要：為了生防型多粘類芽孢桿菌LRS-1的大規模生產應用，以LRS-1固體發酵活菌數為指標，研究了麥麩和草炭基本基質配比、碳源、氮源、初始含水量以及發酵時間、接種量、種齡等條件對LRS-1菌株固體發酵效果的影響;同時，以平板抑菌率為指標，研究了溫度和pH值對LRS-1抑菌穩定性的影響。結果表明：LRS-1的最優固體發酵條件為麥麩與草炭的比例為30∶20，大米添加量12%，小米添加量25%，初始含水量80%，發酵時間6 d， 接種量30%，種齡72 h;LRS-1在30℃左右與中堿性環境中可以保持穩定的抑菌效果。

關鍵詞：生防型多粘類芽孢桿菌LRS-1;固體發酵;抑菌穩定性

中圖分類號：Q939.92文獻標識碼：A文章編號：1006-060X（2020）04-0001-05

Optimization of Solid Fermentation Conditions for LRS-1 against Phytophthora capsicum Disease and Its Antibacterial Stability

ZHANG Liang1，ZHANG Zhou1，TAN Li2，SHENG Hao1，YUAN Hong1，DENG Li-ping3

（1. College of Resources and Environment， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC;

2. Soil Fertilizer Station， Liling Agricultural Bureau， Liling 412200， PRC;

3. Agricultural Technology Promotion Center， Liling 412200， PRC）

Abstract： In order to explore the optimal solid fermentation conditions of Paenibacillus polymyxa LRS-1 and its bacterial inhibition stability， and provide the necessary technical support for the LRS-1's mass production， the effects of the ratio of wheat bran and peat， carbon source， nitrogen source， initial water content ， fermentation time， inoculum size and inoculum age on the solid fermentation effect of LRS-1 with the number of viable bacteria as index， as well as the effect of temperature and pH value on its antibacterial stability with antibacterial rate as index was studied in this paper. The final results showed that the optimal solid fermentation conditions of LRS-1 were：the ratio of wheat bran and peat 30∶20， 12% rice and 25% millet， initial water content 80%， fermentation time 6 d，? inoculum size 30%， inoculum age 72 h. Antibacterial stability showed that at around 30℃ in medium alkaline environment， LRS-1 could maintain the stable antibacterial effect .

Key words： Paenibacillus polymyxa LRS-1; solid fermentation; antibacterial stability

辣椒疫霉病（Phytophthora capsicum Disease）是由卵菌侵染辣椒引起的土傳病害，其病原菌除危害辣椒外，還可侵染黃瓜、茄子、西瓜、南瓜等作物，對其產量和品質構成嚴重威脅[1-2]。該病原菌的卵孢子在土壤中存活時間長，能夠侵染的宿主范圍廣，防治難度較大。以往人們大多采用噴灑化學農藥的方法對辣椒疫霉病害進行防控，但此類手段易對環境與人體健康構成威脅[3-6]。隨著綠色農業的興起，生物防控以其環保、高效等優點成為當下土壤病害防治的熱點和必然選擇[7-9]。

固體發酵是指在沒有或幾乎沒有自由水存在的條件下，以有一定濕度的水不溶性固態基質培養微生物的過程。從生物反應過程的本質考慮，固體發酵是以氣相為連續相的生物反應過程，具有操作簡便、能耗低、發酵過程易控、對無菌要求相對較低、不易發生大面積污染等優點。現今生產中應用的生防活菌劑普遍存在不易保存、活性不穩定等問題，而通過固體發酵生產的菌劑孢子數量多、活性強、便于保藏和運輸， 并且固體發酵設備簡單、成本低廉、易于在生產中應用推廣[10-12]。生防型多粘類芽孢桿菌LRS-1是課題組于水稻土壤中篩選獲得的生防菌株，前期試驗已證實了其對辣椒疫霉病害具有顯著的防治效果，開發利用潛力大[13]。如果將LRS-1菌株進行發酵并制成生物肥料，將對辣椒疫霉病等的土傳病害防治工作起到有力的促進作用。該研究從固體發酵基質、碳氮源、水分控制、發酵時間、接種量等方面進行分析與研究，以探明LRS-1固體發酵的最適條件，同時也研究了LRS-1的熱力抑菌穩定性和酸堿抑菌穩定性，以探明LRS-1穩定抑菌的最適溫度和pH值。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌種 生防型多粘類芽孢桿菌LRS-1：由湖南農業大學資源環境學院土壤微生物實驗室從水稻土壤中分離、鑒定和保存，并經500 μg/mL利福平標記。病原菌：辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）It 263，保存于湖南省植物保護研究所。

1.1.2 發酵培養基 種子培養基：細菌培養采取NBY培養基（營養肉湯粉8 g/L，酵母提取物2 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L， 磷酸二氫鉀0.5 g/L，葡萄糖2.5 g/L，七水合硫酸鎂 1 mol/mL，去離子水配制，瓊脂18 g/L）;真菌培養采用PDA培養基（馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，去離子水配制，瓊脂18 g/L）。液體培養時均不添加瓊脂。固體發酵培養基：以麥麩和草炭為基本基質，添加適宜的碳源、氮源和初始含水量進行發酵。

1.2 試驗方法

1.2.1 生防菌LRS-1種子液的制備 將28℃培養7 d的生防菌LRS-1菌種制成1×106 CFU/mL的菌懸液。取2 mL菌懸液接種于100 mL NBY液體培養基中，于28℃、170 r/min振蕩培養96 h，培養物即為種子液。

1.2.2 生防菌LRS-1固體發酵培養基的優化 （1）基本基質配比的優化。麥麩與草炭比例共設置11個處理，分別為50∶0、45∶5、40∶10、35∶15、30∶20、25∶25、20∶30、15∶35、10∶40、5∶45、0∶50。120℃濕熱滅菌30 min，接入LRS-1種子液，每組重復3次，接種量為5%，28 ℃培養7 d，觀察其生長狀況，然后在含有500 μg/mL利福平的NBY瓊脂培養基上用稀釋平板計數法測定活菌數。（2）碳源與氮源的優化。碳源為玉米淀粉和大米粉，氮源為小米粉和黃豆粉，各設置5個處理。碳源添加量分別為4%、8%、12%、16%、20%;氮源添加量分別10%、15%、20%、25%、30%;對照組不添加碳源和氮源。120℃濕熱滅菌30 min，接入LRS-1種子液，每組重復3次。麥麩與草炭比例為最佳配比，接種量為5%，28 ℃培養7 d，觀察其生長狀況，然后在含有500 μg/mL利福平的NBY瓊脂培養基上用稀釋平板計數法測定活菌數。（3）初始含水量的優化。初始含水量共設置6個處理，分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%;對照組初始含水量為0。120 ℃濕熱滅菌30 min，接入LRS-1種子液，每組重復3次。麥麩與草炭比例為最佳配比，接種量為5%，28℃培養7 d，觀察其生長狀況，然后在含有500 μg/mL利福平的NBY瓊脂培養基上用稀釋平板計數法測定活菌數。

1.2.3 生防菌LRS-1固體發酵條件的優化 （1）發酵時間的確定。將搖床培養3 d的種子液以20%（每100 g固體培養基接種20 mL種子液）的接種量接種于優化后的固體培養基中，并分裝于器皿中，設3次重復，28 ℃靜置培養，分別于第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天各取樣1次，自然風干，粉碎成菌粉，測定含菌量。（2）接種量的確定。取培養3 d的種子液，以5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%的接種量接種于優化后的固體培養基中，28 ℃培養9 d后測定固態發酵物的含菌量。（3）種子液種齡的確定。分別取搖床培養24、36、48、60、72、84、96、108 h的種子液，以20%的接種量接種于優化后的固體培養基中，28 ℃培養9 d后測定固態發酵物的含菌量。

1.2.4 生防菌LRS-1抑菌穩定性的測定 （1）抑菌熱力穩定性的測定。取10份LRS-1菌株液體發酵液，每份5 mL，裝入無菌封口試管中，分別在30、40、50、60、70、80、90、100 ℃水浴鍋中加熱30 min，對照組不加熱，采用平板對峙法（PDA培養基）與病原菌同時接種，培養7 d后觀察抑菌效果，每個處理重復3次。（2）抑菌酸堿穩定性的測定。取10份LRS-1菌株液體發酵液，每份5 mL，裝入無菌封口試管中，分別用0.5 mol/L NaCO3和10%磷酸調節pH值至3、4、5、6、7、8、9、10，靜置1 h后調回初始pH值，采用平板對峙法（PDA培養基）與病原菌同時接種，培養7 d后觀察抑菌效果，對照組不調節pH值，每個處理重復3次。

1.3 測定方法

1.3.1 生防菌LRS-1數量的測定 采用平板計數法進行LRS-1菌落數量的測定[14]，試驗中每1 L瓊脂培養基加入10 mL 500 μg /mL的利福平抗生素。

1.3.2 生防菌LRS-1抑菌性測定 采用平板對峙法進行抑菌效果測定[14]。

1.4 數據處理

采用DPS8.01軟件進行數據分析，采用Excel 2010制圖。

2 結果與分析

2.1 生防菌LRS-1固體發酵培養基的優化

2.1.1 最佳基本基質配比 由圖1可以看出，固體發酵基本基質配比（即麥麩與草炭的添加比例）對生防菌LRS-1的數量有一定的影響，不同配比的固體發酵基質，生防菌LRS-1的數量也不同。當麥麩與草炭的比例為30∶20時，生防菌LRS-1數量的lg值最大，為8.90。因此，麥麩與草炭的最佳配比為30∶20。

2.1.2 最佳碳源與氮源 如圖2所示，與對照相比，添加不同種類的碳源均可以促進生防菌LRS-1的生長，說明單純依靠麥麩與草炭的發酵基質不足以滿足生防菌生長的營養需求，需要額外添加碳源。從圖2中還可以看出，當添加12%的大米時，生防菌LRS-1數量的lg值達到最大，為8.82。因此，宜選用大米作為培養基碳源，其添加量為12%。

如圖3所示，不同種類的氮源對生防菌LRS-1的發酵影響不同。與對照相比，以小米為氮源的處理組發酵菌數均有明顯增加，而以黃豆為氮源的處理組發酵效果隨添加量的增加由促進逐漸轉為抑制。

從圖3中還可以看出，當添加25%的小米時，生防菌LRS-1數量的lg值達到最大，為8.85。因此，宜選用小米作為培養基氮源，其添加量為25%。

2.1.3 最佳初始含水量 在保證初始含水量不改變固體發酵基質形態（即只存在極少量自由水）的前提下，試驗設計了30%～80%的初始含水量處理。從圖4可以看出，與對照相比，當初始含水量低于50%時，活菌數較低，發酵受到抑制;隨著初始含水量的繼續增加，生防菌LRS-1的數量又明顯地增加，說明此時水分對生防菌的發酵起主導作用，結果顯示該試驗條件下80%的初始含水量最適合生防菌LRS-1的固體發酵。

2.2 生防菌LRS-1固體發酵條件的優化

2.2.1 發酵時間的確定 由圖5可以看出，發酵時間對生防菌LRS-1發酵的影響與微生物繁殖規律相符合，即前期呈現出明顯的對數關系，而后趨于平緩。發酵6 d時，生防菌LRS-1數量的lg值達到最大，為8.70。再繼續發酵，其數量基本保持穩定。因此，生防菌LRS-1的最佳發酵時間應為6 d。

2.2.2 接種量的確定 如圖6所示，30%的接種量最適合于生防菌LRS-1的固體發酵，接種量過低或過高均不利于固體培養。接種量低于30%時，生防菌LRS-1在固體基質上生長緩慢，不能深入基質內部，容易被雜菌污染;而接種量高于30%時，水分過多，嚴重阻礙了菌株的生長。

2.2.3 種子液種齡的確定 如圖7所示，培養72 h的生防菌LRS-1種子液接種效果最好，發酵物含菌量最大，其l g值達到8.73，說明此階段的菌體生命力旺盛，能迅速適應基質的固態環境。

2.3 生防菌LRS-1抑菌穩定性分析

2.3.1 抑菌熱力穩定性分析 溫度對菌體的生長和代謝產物生成的影響是非常重要的。一方面影響酶促反應的速度，另一方面影響發酵液的物理性質如粘度、基質和溶氧情況。因此合理選擇和控制發酵溫度對生物活性物質的產生具有重要意義。發酵溫度的確定，理論上應根據發酵過程的不同生理階段而定，但操作難度大。如圖8所示，生防菌LRS-1的抑菌率隨著溫度的升高而降低，30℃時抑菌效果最佳。

2.3.2 抑菌酸堿穩定性分析 生防菌的抑菌效果通常受pH值影響較大。如圖9 所示，當pH值<6時，生防菌LRS-1的抑菌效果不甚理想，而在中堿性環境中，即當pH值>6時，抑菌率>70%，且抑菌效果趨于平穩，說明中性及堿性環境能讓生防菌LRS-1的抑制效果保持穩定。

3 結論與討論

固體發酵是微生物常用的培養工藝，具有操作簡便，產孢量大，培養物便于存儲、運輸和田間應用等特點，而適宜的固態培養條件是保證菌株高效發酵的先決條件。接種量是與培養基利用率直接相關的參數，接種量大盡管可以使菌株生長快、周期短，但后期可能因缺乏營養而無法實現高的產菌數;而接種量太少不僅對營養利用不充分，而且發酵周期長，染菌率高。最佳的種液品質（種齡）是保證接種的前提。發酵時間、發酵載體的碳氮類型及比例、發酵初始含水量均會影響生防菌株的發酵效果，這些指標是研判固體發酵條件的必需參數。該研究以合適比例的麥麩和草炭作為固體發酵的基本基質，并分別添加適量的大米和小米作為碳源和氮源，篩選了適宜的初始含水量，得到了優化的固態培養基，即：麥麩與草炭的比例為30∶20，大米和小米的添加量分別為12%和25%，初始含水量為80%。該研究還探明了生防型多粘類芽孢桿菌LRS-1的最佳基本發酵工藝，即接種量為30%、種齡為72 h、發酵時間為6 d。若要大規模生產，后期還需進行大型的料箱發酵試驗。

生防菌株是具有特殊功效的微生物，保障其抑菌遺傳穩定性具有重要意義[15-19]。LRS-1的熱力穩定性和酸堿穩定性試驗結果表明LRS-1在30℃左右和中堿性環境中可以保持穩定的抑菌效果。

參考文獻：

[1] Hüberli D. Soil health，soil biology，soilborne diseases and sustainable agriculture：a guide[J]. Australasian Plant Pathology，2017，46（4）：387.

[2] Hausbeck M K，Lamour K H. Phytophthora capsici on vegetable crops： research progress and management challenges[J]. Plant Disease，2004，88（12）：1292-1303.

[3] Colla P，Gilardi G，Gullino M L. A review and critical analysis of the European situation of soilborne disease management in the vegetable sector[J]. Phytoparasitica，2012，40（5）：515-523.

[4] Fravel D R. Commercialization and implementation of biocontrol[J]. Annual Review of Phytopathology，2005，43（1）：337-359.

[5] 尹敬芳，劉西莉，李健強. 9種殺菌劑對不同來源辣椒疫霉病菌的毒力比較初探[J]. 植物病理學報，2005，35（1）：84-86.

[6] Katan J. Diseases caused by soilborne pathogens： biology， management and challenges[J]. Journal of Plant Pathology，2017，99（2）：305-315.

[7] 梅新蘭，趙青云，譚石勇，等. 辣椒疫病拮抗菌株篩選、鑒定及其防效[J]. 應用生態學報，2010，21（10）：2652-2658.

[8] 葉旻碩. 不同微生物菌劑對辣椒疫病的防控效果及對土壤性狀的影響[D]. 杭州：浙江農林大學，2019.

[9] 謝梓語，郭恩輝，孫宇波，等. 枯草芽胞桿菌B1409對番茄和辣椒的防病促生作用[J]. 植物保護學報，2018，45（3）：520-527.

[10] 鄧 松，楊志敏，黃 磊，等. 豬糞與玉米稈混合半連續厭氧發酵條件優化研究[J]. 農業生物技術學報，2018，26（7）：1265-1274.

[11] 鄒榮松，李素艷，孟童瑤，等. 一株分離自綠化廢棄物堆肥枯草芽孢桿菌的常壓室溫等離子誘變及其發酵條件[J]. 微生物學通報，2019，46（11）：2919-2926.

[12] 馬艷雯，高華利，李倩文，等. 硫色曲霉SQ-3固態發酵產酶條件的優化[J]. 浙江農業學報，2019，31（6）：970-976.

[13] 趙旖森，張 亮，盛 浩，等. 辣椒疫霉病生防細菌的篩選鑒定及其防效[J]. 中國蔬菜，2019（1）：65-69.

[14] 林先貴. 土壤微生物研究原理與方法[M]. 北京：高等教育出版社，2010.

[15] 江成英，王 松，李 琰，等. 固態發酵玉米黃粉飼料復合菌種的篩選[J]. 中國釀造，2018，37（2）：71-74.

[16] 黃丹蓮，曾光明，黃國和，等. 白腐菌固態發酵條件最優化及其降解植物生物質的研究[J]. 環境科學學報，2005，25（2）：232-237.

[17] 趙光雷，鄭 賽，古 蕓，等. 利用豆粕和小麥秸稈生產多肽的固體發酵工藝條件優化[J]. 應用與環境生物學報，2018，24（1）：20-25.

[18] 劉時輪，李 勇，傅俊范，等. 綠色木霉菌株Tv04-2固體發酵條件研究[J]. 華北農學報，2008，23（S2）：244-247.

[19] 穆燕魁，王占武，張翠綿. 根際益生菌鏈霉菌S506固體發酵條件優化[J]. 微生物學通報，2008，35（10）：1600-1605.

（責任編輯：唐珊珊）