基于SSR分子標記的部分烤煙種質資源遺傳多樣性研究

丁永亮 陳仁霄 苑舉民 管成偉 何寬信 張興偉 李卓 張啟明

摘 ?要：為準確評價部分煙草種質資源的遺傳多樣性，利用42對已發表多態性較好的煙草SSR標記引物對38份烤煙種質資源進行分析，篩選出22對引物在這些種質間存在多態性，平均等位位點數為3.68個，Neis多樣性指數平均為0.451，Shannon信息指數平均達0.789。UPGMA聚類分析表明，紅花大金元有明顯特異性。遺傳結構分析顯示，參試材料可分為2個類群，類群1和類群2分別包含16份和22份種質材料，且類群1變異范圍大于類群2，類群2材料多表現為自然株高在210 cm以下，葉數20～25，莖圍10～11 cm，田間赤星病較嚴重，青枯病發病相對較輕。研究結果為提升SSR分子標記篩選效率和部分烤煙種質創新應用提供理論依據。

關鍵詞：煙草;種質資源;SSR分子標記;遺傳多樣性;遺傳結構

Genetic Diversity of Flue-cured Tobacco Germplasm Resources Based on SSR Molecular Markers

DING Yongliang1， CHEN Renxiao1， YUAN Jumin1， GUAN Chengwei1， HE Kuanxin1，

ZHANG Xingwei2， LI Zhuo1， ZHANG Qiming1*

（1. Tobacco Science Institute of Jiangxi Province， Nanchang 330009， China; 2. Institute of Tobacco Research of CAAS， Qingdao 266101， China）

Abstract： In order to accurately evaluate the genetic diversity of introduced tobacco germplasm resources， 38 tobacco germplasm resources were analyzed with 42 SSR primers with good polymorphism. A total of 22 pairs of polymorphic primers were selected based on higher identification ability. The average number of alleles was 3.68. The average diversity index of Nei was 0.451， and the average Shannon information index was 0.789. The UPGMA cluster analysis showed the specificity of Honghuadajinyuan. The genetic structure analysis showed that these 38 accessions were classified into two groups （group 1 and group 2）， which included 16 and 22 accessions， respectively. The range of variation of group 1 was larger than that of group 2. Most accessions in group 2 showed less than 210 cm in plant height， more than 20 in the number of leaves， 10-11 cm in the stem circumference. Furmore，the accessions in group 2 were susceptible to brown spot disease but resistant to bacterial wilt. The results can provide theoretical basis for improving SSR molecular marker screening efficiency and innovative utilization of some flue-cured tobacco germplasm.

Keywords： tobacco; germplasm resources; SSR molecular marker; genetic diversity; genetic structure

煙草是我國重要經濟作物，在國民經濟發展中發揮著重要作用。優質煙葉是卷煙工業的重要原料，而品種是彰顯煙葉質量特色的關鍵因素之一，對煙葉品質起主導作用[1]。種質資源是選育優良煙草品種的重要基礎[2]，烤煙遺傳背景狹窄是煙草育種發展中的突出問題[3-4]。因此，建立遺傳資源豐富的種質庫尤為重要。分子標記技術目前已廣泛應用于煙草的遺傳多樣性和親緣關系研究，而且在煙草化學成分、普通農藝性狀和抗病性等性狀連鎖基因定位中也取得了一定進展[5]。在基于PCR技術的分子標記方法中，SSR（Simple Sequence Repeats）標記具有多態性高、操作簡單、穩定性好等諸多優點，在許多作物的遺傳多樣性研究中廣泛應用[6]。對于煙草，BINDLER等[7-8]首次報道了其SSR標記，構建了包括2317個SSR標記和2363個位點，并覆蓋24個連鎖群的高密度遺傳圖譜，總遺傳長度為3267 cM，標記間的平均距離小于1.5 cM。此后，SSR分子標記在煙草種質間遺傳多樣性研究中大量應用。葉蘭欽等[9]利用92對煙草SSR標記分析了云南省13個煙草主栽品種的遺傳多樣性，檢測到20對SSR多態性引物。陳夏曄等[10]從960對引物中篩選出34對SSR多態性引物，分析73份煙草抗黑脛病種質，認為其遺傳背景較狹窄。尹國英等[6]從278對引物中篩選出32對多態性較好的SSR引物并對140份煙草種質進行分析，結果表明晾曬煙具有豐富的遺傳多樣性。本研究直接利用前人研究中多態性較高的SSR分子標記，對江西省自存和引進的烤煙種質資源開展遺傳多樣性分析，旨在為煙草新品種的創育和分子標記輔助育種提供理論指導。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

試驗所用烤煙種質資源共計38份（表1），其中18份由國家農作物種質資源平臺煙草種質資源子平臺提供;4份為江西省內自育品系和收集的突變體，其余均從國內各省引進。

1.2 ?試驗地點和方法

1.2.1 ?試驗地點 ?所有材料于2018年3月10日移栽到江西省煙草科學研究所樂安試驗田內，土壤為

砂壤土，無嚴重病蟲害發生。土壤肥力狀況：pH值5.3，有機質含量19.1 g/kg，速效氮含量90.3 mg/kg，速效磷含量24.5 mg/kg，速效鉀含量99.5 mg/kg，氯離子含量0.12 mg/kg。

1.2.2 ?農藝性狀及病害調查 ?采用隨機區組設計，每份材料種植40株，設3次重復，行株距1.20 m×

0.50 m，田間管理和調制按照當地統一模式進行。按照YC/T 142—2010煙草農藝性狀調查測量方法調查各種質單株著生葉數、自然株高、莖圍和節距等農藝性狀，每個小區調查10株。赤星病和青枯病參照GB/T 23222—2008煙草病蟲害分級及調查方法進行調查，其中赤星病每個小區調查50片葉，青枯病調查全部煙株。

1.2.3 ?煙草DNA提取 ?以每份種質嫩葉為材料，利用磁珠法植物DNA提取試劑盒KFR-804496（Thermo Fisher公司）提取總DNA，用超微量分光光度計NANODROP 2000（Thermo Fisher公司）檢測DNA濃度和純度，將其稀釋至約50 ng/μL，?20 ℃保存備用。

1.2.4 ?PCR擴增與檢測 ?采用已發表多態性較好的42對煙草SSR標記引物[6，11-15]，引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。PCR擴增體系參照Ex Taq試劑盒（購自TAKARA公司）說明配制。擴增程序：94 ℃預變性5 min，PCR擴增35個循環，每循環94 ℃變性30 s，55 ℃（視引物而變）退火30 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸10 min。利用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR產物，在180 V恒壓下電泳3 h，用銀染法顯影。

1.2.5 ?數據處理 ?利用Excel 2013軟件統計農藝性狀和病害病情指數。對于SSR帶型，在相同遷移率的位置上，有帶記錄為“1”，無帶記錄為“0”。利用Dataformater軟件對0、1矩陣進行格式轉換，并過濾無多態位點。利用Popgene軟件計算基因多樣性和Shannon信息指數。利用NTSYS-pc 2.10軟件構建UPGMA（非加權組平均法）聚類圖，并利用DCENTER和EIGEN模塊對供試煙草材料進行主成分分析（PCA）。利用Structure 2.3軟件對煙草材料進行群體結構分析，潛在的分組數值K的范圍設置在1～10。根據原始結果，每一個K值將獨立運行10次再取平均值，其中burn-in period 10 000 步，MCMC重復100 000，ΔK參考EVANNO等[16]的算法用來決定最佳組群數量。

2 ?結 ?果

2.1 ?SSR引物多態性分析

PCR擴增產物通過10%非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測結果表明，篩選的42對SSR標記中有27對檢測出等位變異。利用Dataformater軟件對0、1矩陣進行格式轉換，并過濾無多態位點，篩選出22對具有多態位點的SSR標記（表2）。觀測等位基因數變幅在2～5之間，平均為3.68個。有效等位基因數變幅在1.174～2.885之間，平均為1.94個，Shannon信息指數平均為0.789，Neis多樣性指數變幅在0.148～0.653之間，平均為0.451，其中PT20213多樣性指數最高，表明具有較高的鑒別能力（圖1）。

2.2 ?種質資源聚類分析

為確定38份種質材料在基因組上的遺傳關系，利用NTSYS軟件按UPGMA方法進行聚類分析，構建了參試材料的親緣關系圖。由圖2可知，22對多態性引物可將36份種質材料區分歸類，聚類結果與已知種質親緣關系大致相近，美國引進種質和部分突變體材料遺傳距離較近，國內各種質間距離較近。利用DCENTER和EIGEN對供試材料進行主成分分析（圖3），結果表明，38份種質材料大致可分為2個類群，且兩個類群的離散程度存在較大差異。

2.3 ?群體遺傳結構分析

利用Structure軟件對煙草種質材料進行群體結構分析（圖4）得出，群體等位變異頻率特征類型數K呈逐漸增大的趨勢，通過EVANNO等[16]ΔK值來確定K值。ΔK值在K=2時值最大，表明等位變異頻率特征類型數K=2時其模型后驗概率最大，由此可將38份種質材料分為2個類群。煙草38個種質材料的群體遺傳結構如圖5，其中類群1（POP 1）包括G80、K326、Coker86、CV70、CV87、中煙98、中煙102、云煙97、云煙99、云煙110、HY06、粵煙98、FJ109、閩煙9號、紅花大金元、新豐變等16個種質材料，類群2（POP2）包括剩余的22份種質材料。遺傳結構分析與聚類分析在云煙110、云煙97和Coker86等材料的群體劃分結果上存在差異，與主成分分析在云煙110、NC2514、豫煙10號等材料的群體劃分結果上存在差異。

2.4 ?兩個遺傳群體農藝性狀與抗病性變異分析

如圖6所示，群體遺傳結構分析所得兩個群體的農藝性狀和田間主要病害發病情況存在差異。POP1在各農藝性狀統計范圍內均有分布，POP2自然株高均在210 cm以下，99.91%的種質材料自然株高不超過185 cm，著生葉片17.6片以上，莖圍在10.1～11.0 cm范圍內種質數占比高達86.36%，節距集中在3.6～4.9 cm。在赤星病方面，POP1有12.5%的個體發病指數在10以內，POP2發病指數均在10.1以上。在青枯病方面，兩個類群病情指數主要處于0～5.0之間，POP1和POP2在此范圍內的株數分別占比56.25%和81.82%，其中POP2發病指數均在15.0以下。由此可見，POP1的農藝性狀變異范圍大于POP2，POP2材料多表現為株高在210 cm以下，葉片數20～25，莖圍10～11 cm，田間赤星病較嚴重，青枯病發病相對較輕。

3 ?討 ?論

篩選出多態性較好的SSR分子標記是開展煙草SSR相關研究的基礎。張銘真等[17]從250對引物中篩選出64對SSR引物，分析了81份煙草種質資源的遺傳多樣性，平均等位位點數為4.2個。馬冰等[18]從2317對引物中篩選出24對核心引物對20份烤煙種質進行遺傳多樣性分析，平均等位位點數為3.54個。鞠馥竹等[19]從580對引物中篩選出43對多態性引物，平均等位位點數為3.39個。為充分利用前人研究成果，本研究利用42對已發表的多態性較好的SSR標記引物對38份煙草種質材料進行遺傳多樣性分析，篩選到22對引物在這些種質間存在多態性，檢測到81條多態性擴增條帶，平均等位位點數為3.68個，與前人研究相當，但較大程度減少了標記篩選工作量，提升了效率。Neis多樣性指數平均為0.451，Shannon信息指數平均達0.789，說明這些引物總體上有較好的鑒別能力，種質材料具有較高的遺傳多樣性。

本研究所用種質材料包括國外引進種質、國內地方種質和本省自有突變體等，聚類分析和主成分分析發現紅花大金元與大部分種質材料遺傳距離大，可以考慮將其作為親本材料拓寬遺傳背景，發掘優異性狀。聚類及遺傳結構分析顯示美國引進的種質材料遺傳距離近，遺傳背景相似，與MOON等[20]研究結果相一致。聚類分析未能將參試的38份種質材料劃分成明顯的類群，主成分分析初步顯示38份材料可劃分為2個類群，與類群2相比，類群1種質間變異和離散程度更大，這與類群遺傳結構分析的類群間農藝性狀及抗病性變異分析相一致。但是兩個分類結果在云煙110、云煙97和Coker86 3個材料的類群劃分上存在差異，造成這種差異的主要原因是兩者分類依據不同。聚類分析依據的是烤煙材料間的遺傳距離，反映其親緣關系的遠近;而群體遺傳結構分類依據服從Hardy-Weinberg平衡的群體數目，基于數學模型之上，并計算各供試材料間相應的Q值[21]。因此，本試驗利用Structure軟件將供試烤煙材料分為2個類群，具有較高的準確性。此外，關聯分析已廣泛應用于大麥[22]、玉米[23]、小麥[24]、水稻[25]、花生[26]等作物的遺傳育種研究，煙草與農藝性狀[21]、抗病性[27]、致香物質[28]等方面的關聯分析也大量出現，本研究可進一步在農藝性狀、抗病性、化學成分等方面開展多年重復試驗，尋找與性狀緊密相關的標記，以用于分子標記輔助育種研究。

4 ?結 ?論

利用已發表多態性較好的42對煙草SSR標記引物對38份煙草種質材料進行分析，篩選到22對引物在這些種質間存在多態性，平均等位位點數為3.68個。參試的38份煙草種質具有較高的遺傳多樣性，UPGMA聚類分析顯示紅花大金元具有明顯特異性。遺傳結構分析顯示，參試材料可分為2個類群，在農藝性狀和抗病性方面，類群1變異范圍大于類群2，類群2材料多表現為株高在210 cm以下，葉數20～25，莖圍10～11 cm，田間赤星病較嚴重，青枯病發病相對較輕。本研究結果為提升SSR分子標記篩選效率和部分烤煙種質創新應用提供理論依據，并為進一步與農藝性狀、抗病性、化學成分等方面開展關聯分析奠定了基礎。

參考文獻

[1]中國農業科學院煙草研究所. 中國煙草栽培學[M]. 上海：上海科學技術出版社，2005.

Institute of Tobacco Research of CAAS. Tobacco cultivation in China[M]. Shanghai： Shanghai Science And Technology Press， 2005.

[2]張艇. 煙草種質資源的遺傳多樣性研究[J]. 農技服務，2010，27（1）：101-103.

ZHANG T. Research on genetic diversity of tobacco germplasm resource[J]. Agricultural Technology Services， 2010， 27（1）： 101-103.

[3]孫計平，吳照輝，李雪君，等. 21世紀中國烤煙種植區域及主栽品種變化分析[J]. 中國煙草科學，2016，37（3）：86-92.

SUN J P， WU Z H， LI X J， et al. Analysis of regional variation and major varieties of flue-cured tobacco planted in China in the 21 century[J]. Chinese Tobacco Science， 2016， 37（3）： 86-92.

[4]陳雅瓊，王衛峰，丁安明，等. 基于SSR熒光標記分析我國主要審（認）定烤煙及白肋煙品種遺傳多樣性[J]. 中國煙草學報，2013，19（2）：98-105.

CHEN Y Q， WANG W F， DING A M， et al. Analysis of genetic diversity in national listed tobacco varieties using SSR fluorescent marker data[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2013， 19（2）： 98-105.

[5]羅昭標，陳歡，毛華，等. 分子標記在煙草性狀連鎖基因定位中的應用進展[J]. 生物技術通訊，2014，25（1）：139-142.

LUO Z B， CHEN H， MAO H， et al. Progress of the application of molecular markers in gene mapping of tobacco characters [J]. Letters In Biotechnology， 2014， 25（1）： 139-142.

[6]尹國英，楊小燕，何其波，等. 鑒定煙草種質資源SSR核心引物篩選和驗證[J]. 植物遺傳資源學報，2013，14（5）：960-965.

YIN G Y， YANG X Y， HE Q B， et al. Screen and identification of SSR core primers for tobacco germplasm[J]. Journal of Plant Genetic Resources， 2013， 14（5）： 960-965.

[7]BINDLER G， VAN DER HOEVEN R， GUNDUZ I， et al. A microsatellite marker based linkage map of tobacco[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2007， 114（2）： 341-349.

[8]BINDLER G， PLIESKE J， BAKAHER N， et al. A high density genetic map of tobacco （Nicotiana tabacum L.） obtained from large scale microsatellite marker development[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2011， 123（2）： 219.

[9]葉蘭欽，辛明明，杜金昆，等. SSR標記應用于煙草品種遺傳多樣性研究[J]. 中國農學通報，2009，25（1）：56-62.

YE L Q， XIN M M， DU J K， et al. Genetic diversity revealed by SSR markers of the tobacco cultivars[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2009， 25（1）： 56-62.

[10]陳夏曄，劉艷華，張興偉，等. 抗黑脛病煙草種質的遺傳多樣性分析[J]. 中國農學通報，2014，30（7）：58-63

CHEN X Y， LIU Y H， ZHANG X W， et al. Genetic diversity analysis on resistant tobacco germplasm to black shank disease[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2014， 30（7）： 58-63.

[11]賴瑞強，李榮華，夏巖石，等. 煙草種質的SSR標記遺傳多樣性及青枯病抗性的關聯分析[J]. 中國煙草學報，2018，24（6）：67-77.

LAI R Q， LI R H， XIA Y S， et al. SSR marker-based genetic diversity analysis of tobacco germplasm and association analysis with resistance to bacterial wilt[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2018， 24（6）： 67-77.

[12]張興偉，任民，劉艷華，等. 煙草核心引物的篩選[C]//中國煙草2013年學術年會論文集. 北京：中國煙草學會，2013：109-114.

ZHANG X W， REN M， LIU Y H， et al. Screening of SSR core primers with polymorphism on 12 tobacco accessions[C]//Proceedings of the 2013 China tobacco annual conference. Beijing： China Tobacco Society， 2013： 109-114.

[13]向世鵬，胡日生，周向平，等. 煙草種質資源黑脛病抗性鑒定及親緣關系SSR分析[J]. 華北農學報，2016，31（1）：156-161.

XIANG S P， HU R S， ZHOU X P， et al. Identification of resistance to black shank disease of tobacco germplasm resources and analysis of genetic relationship of SSR[J]. Acta Agriculturae Boreali-sinica， 2016， 31（1）： 156-161.

[14]陳芳，徐世曉，李曉輝，等. 基于SSR標記的80份煙草種質指紋圖譜的構建及遺傳多樣性分析[J]. 作物雜志，2019（1）：22-31.

CHEN F， XU S X， LI X H， et al. Construction of molecular fingerprinting and analysis of genetic diversity for 80 tobacco （Nicotiana tabacum） germplasms[J]. Crops， 2019（1）： 22-31.

[15]張銘真，邢雪霞，李曉輝，等. 煙草種質資源遺傳多樣性與群體結構分析[J]. 中國煙草科學，2016，37（4）：42-47.

ZHANG M Z， XING X X， LI X H， et al. Analysis of genetic diversity and population structure of germplasm resources in Nicotiana tobacum[J]. Chinese Tobacco Science， 2016， 37（4）： 42-47.

[16]EVANNO G， REGNAUT S， GOUDET J. Detecting the number of clusters of individuals using the software structure： a simulation study[J]. Molecular Ecology， 2005， 14（8）： 2611-2620.

[17]張銘真，李曉輝，王袁，等. 81份煙草種質資源遺傳多樣性分析[J]. 江西農業學報，2017，29（1）：62-68.

ZHANG M Z， LI X H， WANG Y， et al. Analysis of genetic diversity of 81 tobacco germplasm resources[J]， Acta Agricultural Jiangxi， 2017， 29（1）： 62-68.

[18]馬冰，代帥帥，程亞增，等. 烤煙種質資源SSR核心引物的篩選及驗證[J]. 中國煙草科學，2016，37（5）：1-5，9.

MA B， DAI S S， CHENG Y Z， et al. Screen and identification of SSR core primers for flue-cured tobacco germplasm[J]. Chinese Tobacco Science， 2016， 37（5）： 1-5， 9.

[19]鞠馥竹，趙文濤，劉元德，等. 不同產區晾曬煙資源多樣性的鑒定與評價[J]. 中國煙草科學，2019，40（2）：8-15.

JU F Z， ZHAO W T， LIU Y D， et al. Identification and evaluation of the diversity of air/sun-cured tobacco germplasm resources in different producing areas[J]. Chinese Tobacco Science， 2019， 40（2）： 8-15.

[20]MOON H S， NIFONG J M， NICHOLSON J S， et al. Microsatellite-based analysis of tobacco （Nicotiana tabacum L.） genetic resources[J]. Crop Science， 2009， 49： 2149-2159.

[21]童治軍，陳學軍，方敦煌，等. 231份烤煙種質資源SSR標記遺傳多樣性及其與農藝性狀和化學成分的關聯分析[J]. 中國煙草學報，2017，23（5）：31-61.

TONG Z J， CHEN X J， FANG D H， et al. SSR marker-based analyses on genetic diversity and relevant variations of agronomic traits and chemical composition of 231 flue-cured tobacco germplasm resource[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2017， 23（5）： 31-61.

[22]IVANDIC V， HACKETT C A， NEVO E， et al. Analysis of simple sequence repeats （SSR） in wild barley from the fertile crescent： associations with ecology， geography and flowering time[J]. Plant Molecular Biology， 2002， 48： 511-527.

[23]FLINT-GARCIA S A， THUILLET A C， YU J， et al. Maize association population： a high-resolution platform for quantitative trait locus dissection[J]. The Plant Journal， 2005， 44（6）： 1054-1064.

[24]ROY J K， BANDOPADHYAY R， RUSTGI S， et al. Association analysis of agronomical important traits using SSR， SAMPL and AFLP markers in bread wheat[J]. Current Science， 2006， 90（5）： 683-689.

[25]AGRAMA H A， EIZENGA G C， YAN W. Association mapping of yield and its components in rice cultivars[J]. Molecular Breeding， 2007， 19（4）： 341-356.

[26]李東霞，石鵬，楊偉波，等. 利用SSR分子標記分析海南與國內外花生種質資源的遺傳多樣性[J]. 廣東農業科學，2015，42（20）：118-124.

LI D X， SHI P， YANG W B， et al. Analysis of genetic diversity in peanut（Arachis hypogaea L.）germplasm resources from Hainan and other regions by using SSR markers[J]. Guangdong Agricultural Sciences， 2015， 42（20）： 118-124.

[27]叢鑫，劉艷華，戴培剛，等. 抗PVY煙草種質的遺傳多樣性分析[J]. 植物遺傳資源學報，2014，15（3）：679-684.

CONG X， LIU Y H， DAI P G， et al. Genetic diversity analysis of tobacco germplasm resistance to PVY[J]. Journal of Plant Genetic Resources， 2014， 15（3）： 679-684.

[28]任民，張長靜，蔣彩虹，等. 基于高密度SSR連鎖群的煙草致香物質關聯分析[J]. 中國煙草學報，2014，20（4）：88-93.

REN M， ZHANG C J， JIANG C H， et al. Association analysis of tobacco aroma constituents based on high density SSR linkage group[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2014， 20（4）： 88-93.

基金項目：江西省煙草公司科技項目“煙草種質資源的收集引進與種質庫建立”（201401001）

作者簡介：丁永亮（1990-），男，農藝師，碩士，從事煙草育種及生物技術研究。E-mail：yld9001@163.com

*通信作者，E-mail：zhangqiming1979@163.com

收稿日期：2019-10-23 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 修回日期：2020-02-14