煙草CYP71D亞家族的生物信息學(xué)分析

王蕾 趙澤玉 陳明麗 龔達(dá)平

摘 ?要：細(xì)胞色素P450（CYP450）是一類(lèi)超基因家族編碼的多功能氧化酶，在生物合成、代謝解毒及植物防御方面具有重要作用。其中CYP71D屬于CYP450的一個(gè)亞家族，主要在次生代謝物合成和病蟲(chóng)害防御方面起作用。為了更好地了解煙草CYP71D亞家族基因特征和功能，本研究利用生物信息學(xué)分析手段及煙草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)CYP71D亞家族基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)等進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在煙草中共有42個(gè)CYP71D亞家族成員，各成員在染色體上并非均勻分布，其氨基酸長(zhǎng)度和等電點(diǎn)差異較大，但基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域數(shù)目和分布高度一致;二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，煙草CYP71D亞家族成員具備P450蛋白特征結(jié)構(gòu)域;基因表達(dá)模式分析顯示，多數(shù)CYP71D基因在根、葉、花中特異表達(dá)，大部分基因參與了IAA激素、黑脛病、溫度等逆境脅迫反應(yīng)。這為煙草CYP71D亞家族基因功能的深入研究及煙草抗逆品種的培育奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：煙草;CYP71D亞家族;生物信息學(xué)分析

Bioinformatic Analysis of CYP71D Subfamily Genes in Tobacco （Nicotiana tabacum L.）

WANG Lei1，2， ZHAO Zeyu1，2， CHEN Mingli1， GONG Daping1*

（1. Tobacco Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China）

Abstract： Cytochrome P450 （CYP450） is a supergene family which encodes multifunctional oxidase， playing an important role in biosynthesis， metabolic detoxification， and plant defense. In CYP450 family， the CYP71D subfamily genes mainly function in secondary metabolite synthesis and pest control. In order to better understand the genetic characteristics and functions of tobacco CYP71D subfamily genes， their gene structure and expression pattern were analyzed by bioinformatics tools and transcriptome data. The results showed that there are 42 members in tobacco CYP71D subfamily and they were distributed on the chromosome unevenly. Besides， their amino acid lengths and isoelectric points were quite different， while their gene structure and conserved-domain distribution were highly consistent. The secondary structure analysis showed that CYP71D subfamily members contained the typical conserved domains in P450 proteins. The gene expression pattern analysis showed that most CYP71D genes were specifically expressed in roots， leaves and flowers， and some of them were induced by various elicitors， including phytohormone IAA， temperature and black shank. This study contributes to further researches in the function of CYP71D subfamily genes and breeding for stress-resistant tobacco cultivars.

Keywords： tobacco; CYP71D subfamily; bioinformatics analysis

細(xì)胞色素P450（cytochrome P450）是一類(lèi)以血紅素為輔基的B族細(xì)胞色素超家族蛋白酶，經(jīng)過(guò)進(jìn)化擴(kuò)張形成，廣泛存在于各種動(dòng)物、植物、真菌和細(xì)菌中，是植物代謝中最大的酶家族[1]。1969年FREAR[2]首次在棉花（Gossypium hirsutum L.）發(fā)現(xiàn)P450s，隨后陸續(xù)在其他多種植物中發(fā)現(xiàn)了P450s，如擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）[3]，水稻（Oryza sativa L.）[4]，苜蓿（Medicago sativa L.）[5]，菜豆（Phaseolus vulgaris L.）[6]等。目前已從植物中發(fā)現(xiàn)了127個(gè)P450基因家族，分為11個(gè)簇，包括單家族簇和多家族簇。CYP71簇（簡(jiǎn)稱(chēng)71 clan）是一個(gè)多家族簇，包含CYP71、CYP82、CYP93等多個(gè)家族，覆蓋了超過(guò)半數(shù)的P450基因[7-8]。CYP71D亞家族則位于CYP71簇的CYP71家族。

植物P450的功能主要?dú)w為兩大類(lèi)，一類(lèi)參與植物次生代謝物質(zhì)的合成，如苯丙烷、萜類(lèi)、植物激素類(lèi)、黃酮類(lèi)、木質(zhì)素和生物堿等[9];一類(lèi)參與解毒途徑，催化外源化合物如除草劑、殺蟲(chóng)劑等變成非毒性物質(zhì)[10]。CYP71D亞家族在植物中主要參與生物堿類(lèi)、萜類(lèi)、黃酮類(lèi)等抗病原物有關(guān)次生代謝物的合成。辣椒CYP71D19 （AF122821）形成的產(chǎn)物在病菌侵染果實(shí)表皮時(shí)起保護(hù)作用[11];煙草CYP71D20能體外催化5-非手性-馬兜鈴烯（5-epi-aristolochene）和1-脫氧衣殼二醇（1-deoxycapsidiol）形成萜類(lèi)植保素-甜椒素[12];煙草腺毛中的CYP71D16能催化葉面香氣物質(zhì)西柏三烯二醇的合成[13-16]，但并不受外源MeJA的誘導(dǎo)[17]。

煙草是重要的經(jīng)濟(jì)作物，也是重要模式植物之一。解敏敏等[18]從煙草基因組中鑒定了44個(gè)P450家族，共263個(gè)成員，并分析了P450基因在各個(gè)組織的表達(dá)情況，但對(duì)煙草CYP71D亞家族基因功能的研究還不夠詳細(xì)。本研究采用生物信息學(xué)的方法從煙草基因組中鑒定了42個(gè)CYP71D基因，并分析了CYP71D亞家族成員的基因結(jié)構(gòu)、二級(jí)元件及表達(dá)模式，以期為煙草CYP71D基因的功能研究及抗病蟲(chóng)品種的培育提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?煙草CYP71D亞家族成員的鑒定及理化性質(zhì)分析

從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam.xfam.org/）下載P450家族種子序列（Pfam ID： PF00067），用HMMER3.0檢索煙草K326蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)[19]（https：//solgenomics.net/），獲得候選P450蛋白。將其與番茄P450家族（http：//drnelson.uthsc.edu/ CytochromeP450.html）比對(duì)得到候選煙草CYP71D蛋白序列[20]。利用ExPASy ProtParam （http：//web.expasy.org/protparam/）分析煙草CYP71D亞家族成員的氨基酸長(zhǎng)度、分子量和等電點(diǎn)等理化性質(zhì)。

1.2 ?煙草CYP71D亞家族基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域和二級(jí)結(jié)構(gòu)元件分析

利用MEGA 7.0對(duì)CYP71D亞家族基因進(jìn)行多序列比對(duì)構(gòu)建鄰接進(jìn)化樹(shù)。利用基因預(yù)測(cè)信息分析CYP71D亞家族成員基因結(jié)構(gòu)，利用MEME （http：//meme-suite.org/）預(yù)測(cè)分析CYP71D亞家族成員蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域，使用TBtools軟件進(jìn)行可視化。以PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb.org/ pdb/home/home.do）獲得的擬南芥AtAOS （CYP74A）的結(jié)構(gòu)信息為模板分析CYP71D亞家族成員的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3 ?煙草CYP71D亞家族基因表達(dá)模式聚類(lèi)分析

從NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/sra/）下載煙草轉(zhuǎn)錄組（RNA-seq）數(shù)據(jù)，包括TN90各個(gè)組織（根、莖、幼葉、成熟葉、衰老葉、未成熟花、成熟花、衰老花和果實(shí)）;在H2O和IAA中處理24和72 h的南江3號(hào)種子;感染黑脛病12、72 h的紅花大金元成熟莖組織;高溫、中溫、低溫脅迫下20、40、60 d云煙87的根和葉組織;4 ℃處理0、4、24、48 h的NC567和臺(tái)煙8號(hào)葉組織。利用TopHat2[21]和Cufflink程序分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并計(jì)算表達(dá)量，使用pheatmap程序繪制熱圖。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?煙草CYP71D亞家族成員的鑒定及理化性質(zhì)分析

應(yīng)用HMMER3.0軟件檢索煙草K326蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，共獲得639條候選P450蛋白序列。將其與番茄每個(gè)亞家族P450蛋白序列比對(duì)，鑒定了煙草CYP71D亞家族中93個(gè)成員。剔除過(guò)短片段（氨基酸序列<350）和不包含K螺旋（ExxR）及血紅素結(jié)合域（FxxGxxxCxG）的蛋白[22]，最終得到42個(gè)煙草CYP71D亞家族成員（表1）。煙草CYP71D基因在17條染色體上并非隨機(jī)分布。其中22號(hào)染色體上分布數(shù)量最多，有10個(gè)基因。在scaffold Nitab4.5_0000390上有4個(gè)CYP71D基因串聯(lián)分布，在scaffold Nitab4.5_0001182、Nitab4.5_0001264、Nitab4.5_0004164、Nitab4.5_0006052和Nitab4.5_ 0008401上分別有2個(gè)CYP71D基因串聯(lián)分布。對(duì)煙草CYP71D亞家族成員理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，除Nitab4.5_0000163g0260.1外，其他成員氨基酸長(zhǎng)度在417～559 aa之間，分子量介于47～63 kD左右，理論等電點(diǎn)在6.39～9.44之間（表1）。

2.2 ?煙草CYP71D亞家族基因結(jié)構(gòu)與保守結(jié)構(gòu)域分析

系統(tǒng)進(jìn)化分析和基因結(jié)構(gòu)分析顯示（圖1），煙草CYP71D亞家族大部分成員只有一個(gè)內(nèi)含子，小部分成員包含多個(gè)內(nèi)含子，多由較長(zhǎng)的2個(gè)外顯子和幾個(gè)非常短的外顯子組成。CYP71D亞家族成員間基因結(jié)構(gòu)與進(jìn)化距離存在緊密聯(lián)系，親緣關(guān)系

越近則基因結(jié)構(gòu)越相似，內(nèi)含子大小越接近。利用MEME搜索煙草CYP71D亞家族成員的保守基序顯示，亞家族成員保守基序（motif）的種類(lèi)、數(shù)目和分布高度一致[23]。其中，31個(gè)含有全部10個(gè)保守基序，11個(gè)存在1～3個(gè)保守基序的缺失。

2.3 ?煙草CYP71D亞家族二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及分析

以擬南芥AtAOS （CYP74A）基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)為模板，對(duì)煙草CYP71D基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明（圖2），所有CYP71D家族蛋白序列中都含有P450蛋白典型的保守結(jié)構(gòu)域，包括PERF結(jié)構(gòu)域（PxRx）、K螺旋（ExxR）和C末端的血紅素結(jié)合域（FxxGxxxCxG）。血紅素結(jié)合域是鑒定P450蛋白的主要特征結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)域中存在與鐵元素形成硫醇鹽離子鍵的絕對(duì)保守的半胱氨酸殘基（Cys），K螺旋中的谷氨酸（Glu）和精氨酸（Arg）也絕對(duì)保守[24]，參與P450核心結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，與PERF結(jié)構(gòu)域形成鹽橋發(fā)生相互作用。6個(gè)底物識(shí)別位點(diǎn)（substrate recognition sites，SRS）[25]通過(guò)誘導(dǎo)-契合機(jī)制識(shí)別底物，與底物結(jié)合參與隨后的催化反應(yīng)，這些可變區(qū)域存在較大差異。

2.4 ?煙草CYP71D亞家族基因表達(dá)模式分析

煙草不同組織及誘導(dǎo)脅迫下的CYP71D基因表達(dá)數(shù)據(jù)聚類(lèi)分析顯示，煙草CYP71D基因的表達(dá)模式大致分為6個(gè)不同的類(lèi)群，如圖3所示。第1類(lèi)基因，除Nitab4.5_0005698g0010.1受溫度脅迫在根和葉中表達(dá)外，其他基因主要在花中表達(dá)。第2類(lèi)基因，部分具有組織特異性表達(dá)，如Nitab4.5_0000418g0010.1和Nitab4.5_0001264g0080.1僅在衰老花中特異表達(dá)，并且Nitab4.5_ 0000418g0010.1在黑脛病感染的莖組織中表達(dá)量上調(diào)，Nitab4.5_0001264g0080.1在IAA中吸脹24 h和未經(jīng)處理萌發(fā)72 h的種子中高表達(dá);Nitab4.5_0000977g0140.1在未經(jīng)處理的休眠種子中特異表達(dá)，在H2O和IAA中吸脹后萌發(fā)72 h的種子中表達(dá)量較高;該類(lèi)剩余其他基因在所有組織中都幾乎不表達(dá)。第3類(lèi)基因，在根、休眠種子中表達(dá)量較高，受IAA、溫度和黑脛病菌脅迫調(diào)控。第4類(lèi)基因可能是參與溫度響應(yīng)的基因，在根中的表達(dá)受溫度脅迫調(diào)控。第5類(lèi)基因主要在葉和根組織中表達(dá)，受溫度、黑脛病菌誘導(dǎo)。第6類(lèi)基因，可能是參與脅迫應(yīng)答的基因，受IAA、黑脛病菌、溫度等多個(gè)因素誘導(dǎo)調(diào)控，在休眠種子和根中高表達(dá)。

3 ?討 ?論

本研究利用生物信息學(xué)方法，從煙草基因組中鑒定得到了42個(gè)CYP71D亞家族成員。相比番茄基因組中16個(gè)CYP71D基因[26]，煙草CYP71D基因的數(shù)目是番茄的2.6倍，這可能是由于煙草為異源四倍體，大多數(shù)基因包含兩個(gè)拷貝。CYP71D基因在染色體上并非均勻分布，一半成員成簇分布，這可能是基因復(fù)制的結(jié)果[27]。CYP71D亞家族成員間內(nèi)含子保守情況與進(jìn)化相關(guān)[28]，煙草CYP71D亞家族中大多數(shù)成員只有一個(gè)內(nèi)含子，進(jìn)化距離越近，內(nèi)含子長(zhǎng)度越接近，基因結(jié)構(gòu)越相似。

P450功能的多樣性是為了適應(yīng)各種組織不同代謝途徑和環(huán)境脅迫進(jìn)化的結(jié)果。大多數(shù)進(jìn)化距離較近的CYP71D亞家族成員在表達(dá)譜特征上也比較相似，說(shuō)明他們可能具有類(lèi)似的功能。大多數(shù)P450基因在植物各組織中表達(dá)量較低，特別是一些參與內(nèi)源信號(hào)分子代謝途徑的P450基因，受外界生物與非生物脅迫誘導(dǎo)時(shí)才響應(yīng)表達(dá)。煙草CYP71D基因的表達(dá)模式分析表明，CYP71D亞家族基因在IAA誘導(dǎo)、黑脛病和溫度脅迫下，表達(dá)量發(fā)生不同程度的上調(diào)或下調(diào)，該CYP71D家族可能主要參與外界脅迫應(yīng)答反應(yīng)。

休眠種子和萌發(fā)種子中CYP71D基因的表達(dá)模式完全相反。CYP71D基因在生長(zhǎng)素響應(yīng)的種子次生休眠過(guò)程中可能參與了黃酮醇生物合成、赤霉素代謝等，在生長(zhǎng)素響應(yīng)的種子萌發(fā)過(guò)程中可能參與了脫落酸、生長(zhǎng)素、茉莉酸和水楊酸介導(dǎo)的激素信號(hào)通路[29]。在黑脛病菌誘導(dǎo)下，煙草CYP71D亞家族有近一半的基因表達(dá)量發(fā)生變化。李立芹等[30]、蘇振剛等[31]運(yùn)用抑制性消減雜交技術(shù)（SSH）篩選的黑脛病抗性相關(guān)的差異表達(dá)基因中也包含了P450基因。此外，在煙草抗黑脛病過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有5個(gè)miRNA的靶基因編碼細(xì)胞色素P450[32-33]。這表明P450基因在煙草對(duì)黑脛病的抗病過(guò)程中起著非常重要的作用。當(dāng)煙草根和葉受冷熱脅迫時(shí)，顯著影響煙草生理特征[34]，本研究中分別有約1/2和1/3的CYP71D基因表達(dá)量發(fā)生變化。已有研究表明，在多年生黑麥草和高羊茅中，CYP71家族基因參與溫度脅迫響應(yīng)[35]。茶樹(shù)在冷熱脅迫下，CYP71A26基因表達(dá)量下降，而CYP71B34表達(dá)量上升[36]。本研究還發(fā)現(xiàn)，煙草部分CYP71D成員受多種逆境脅迫和激素響應(yīng)均出現(xiàn)表達(dá)量明顯變化，這些基因具體的分子調(diào)控機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

4 ?結(jié) ?論

本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法從煙草基因組中鑒定出42個(gè)CYP71D亞家族基因，這些基因在染色體上并非均勻分布，理化性質(zhì)差異較大，但基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域高度一致。表達(dá)模式分析表明，CYP71D亞家族大部分基因參與IAA誘導(dǎo)、黑脛病和溫度等脅迫過(guò)程，可能在植物防御反應(yīng)方面具有重要的作用。這為CYP71D亞家族基因功能的深入研究和抗逆煙草品種的培育提供了參考。

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基金項(xiàng)目：中國(guó)煙草總公司科技重大專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目“K326和紅花大金元品種蚜蟲(chóng)抗性的定向改良”[110201801024（JY-01）]

作者簡(jiǎn)介：王 ?蕾（1994-），女，碩士研究生，主要從事作物遺傳育種研究。E-mail：wanglei941220 @163.com

*通信作者，E-mail：gongdaping@caas.cn

收稿日期：2019-10-16 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 修回日期：2020-01-02