陳化煙葉細菌區系的高效分離及增殖技術研究

殷爽 孫萬萬 王毅 季秀玲 張琦 魏云林

摘 ?要：對陳化煙葉的細菌區系進行高效分離及擴增，獲得最適助分離劑和分離條件，選取在玉溪陳化，等級為WDC3F的K326煙葉為試驗材料，使用4種不同的助分離劑對陳化煙葉細菌區系進行了分離，同時對分離的細菌區系進行了培養增殖，利用可培養和免培養法對培養前后的細菌區系多樣性進行了評價和分析。結果表明，以1‰ SDS為助分離劑對陳化煙葉細菌區系進行分離，分離率相對于傳統方法提高了489.58%。培養溫度為15 ℃時，使用煙葉浸液培養基不僅可使煙葉表面細菌總量增殖約100倍，而且可以較好地保留區系的多樣性。免培養分析表明，培養增殖前后的細菌區系結構存在一定差異，但其細菌群落代謝功能并沒有顯著差異，這表明擴增后的細菌區系仍然具備了原細菌區系的生理功能。本研究探索并建立了陳化煙葉細菌區系的高效分離方法，為陳化煙葉微生物資源的開發提供了理論基礎。

關鍵詞：細菌區系;陳化煙葉;分離;增殖;分析

Isolation and Amplification of the Microbiota from Aging Tobacco Leaves

YIN Shuang1， SUN Wanwan1， WANG Yi2， JI Xiuling1， ZHANG Qi1， WEI Yunlin1*

（1. Kunming University of Science and Technology， Kunming 650500， China; 2. Technology Center， China Tobacco Yunnan Industrial Co.， Ltd.， Kunming 650231， China）

Abstract： In order to collect microbiota efficiently from tobacco leaves during aging process and obtain the most suitable separating agent and conditions. The K326 toabacco with WDC3F grade from Yuxi area were used as the experimental material in this study. The bacterial floras of aging tobacco leaves were collected by using four separation solutions. Meanwhile， the collected bacterial flora was cultured and amplified. The bacterial flora diversity was also evaluated before and after the culture using culturable and non-culturable analysis. The results showed that an effective method for collecting microbiota of aging tobacco leaves with 1‰ SDS as a helper in separation solution was found that the collection rate was increased by 489.58% compared with the traditional method.， The tobacco leaf infusion medium supplemented with tobacco leaf extract could not only increase the total number of bacterial flora by 100 folds， but also preserve the flora diversity under the culture condition of 15 ℃. The results by non-culturable analysis showed that the structures of bacterial flora in amplified sample were changed， but there was no significant differences in the bacterial community metabolic function， which indicated that the amplified bacterial flora kept the same physiological functions as original bacterial flora. So， this study established an efficient collection and amplification method for the bacterial flora from aging tobacco leaves， which provided a basis for the development of aged tobacco leaf microorganism resources.

Keywords： microbiota; aging tobacco; microbiota collection; proliferation of bacterial biota; analysis of bacterial biota

陳化煙葉表面存在著大量的微生物，包括細菌、真菌和少量放線菌，它們所組成的微生物群落稱為“陳化煙葉微生物區系”[1-4]。研究表明微生物區系是煙葉陳化主要的生物因素之一，可通過多個途徑調節煙葉陳化過程，最終使陳化煙葉的內在品質得到改善，更加符合人們的使用需求[5-6]。微生物區系在陳化植物中起著重要作用。

從自然陳化的煙葉表面分離得到的微生物區系中，細菌是主要組成成分，真菌及其他微生物在陳化過程中作用十分有限。部分功能性細菌在陳化植物中的作用受到人們的關注，但從細菌區系角度進行系統研究的少見報道[7-8]。植物在生長過程中產生非常復雜的次生代謝產物，后期經過陳化會使其轉化得更復雜，這些都影響著植物陳化過程中微生物區系的組成與分離[9-12]。目前細菌區系分離方法主要采用分步離心法和超聲破碎法。分步離心法會導致樣品懸浮液中的可培養微生物種類減少，超聲破碎法則會隨著超聲波振蕩時間的延長造成溶液中的微生物量變化，這兩種方法均不能完整的分離獲得陳化煙葉表面的細菌區系[13-15]。如何高效分離和系統分析陳化煙葉細菌區系是亟待解決的問題。

本研究選用在玉溪進行陳化等級為WDC3F的K326煙葉為材料，通過在分離液中添加不同助分離劑，探索助分離劑的最適濃度以及分離條件，為陳化煙葉細菌區系的高效分離提供理論依據，并為煙葉微生物資源開發提供一定的理論基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

于2018年9—10月，采集云南省玉溪市研和縣（24°8′36″N，102°28′30″E，平均海拔2100 m）陳化等級為WDC3F的K326煙葉。

1.1.1 ?試驗試劑與儀器 ?Mix，通用引物等由北京碩擎公司合成;16S rRNA回收試劑盒，GeneJET膠回收試劑盒，吐溫20均購自索萊寶公司;Trizol，玻璃珠（直徑0.1 mm）購自Ambion公司;基因組提取試劑盒使用TSINGKE植物DNA提取試劑盒（通用型）。其他化學試劑均為國產分析純。

1.1.2 ?試驗培養基 ?LB 培養基：酵母粉 5 g/L，胰蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0。PYGV培養基：Tryptone 0.25 g，酵母粉 0.25 g，25%葡萄糖 10 mL，維生素溶液 5 mL，無機鹽溶液 20 mL，定容于1 L。煙葉浸液培養基：酵母粉 0.5 g，胰蛋白胨 1 g，NaCl 1 g，以煙葉浸出液（取10 g煙葉用250 mL蒸餾水浸提30 min，過濾后滅菌）定容于1 L。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?陳化煙葉細菌區系的分離及優化 ?據文獻[26]方法分離，具體如下：稱取玉溪陳化等級為WDC3F的K326煙葉10 g，剪碎（1×1 cm）后移至裝有250 mL的分離液（NaCl 8.5 g/L，121 ℃滅菌15 min）的三角瓶中。經搖床振蕩、過濾、離心后等梯度稀釋涂布，通過平板計數法進行計數。以上述分離液為對照，往三角瓶中分別加入1‰、2‰、3‰、4‰、5‰的SDS（m/V），研究不同濃度SDS對分離陳化煙葉細菌區系的影響;分別加入1‰（m/V）SDS、25顆玻璃珠、1%（m/V）吐溫20以及1%（m/V）Trizol，研究不同助分離劑對分離細菌區系的影響。

將分離液進行等梯度稀釋，通過平板計數法計數。同時觀察菌落形態并進行菌落種屬鑒定。

1.2.2 ?陳化煙葉細菌區系的增殖培養及培養基篩選 ?分別取100 L的分離液于不同的培養基中按表1方式培養后，通過平板計數法計數并進行菌落種屬鑒定。

1.2.3 ?細菌區系的種屬鑒定 ?采用基因組提取試劑盒提取陳化煙葉表面微生物區系的總DNA，擴增16S rDNA基因序列（通用引物：515F，5'-ATACTATGATACTGGCTCCA-3'，806R，

5'-AGTTACGTTGCTACGACAT-3'），切膠回收后送云南同創檢測技術股份有限公司進行宏基因組測序、鑒定種屬。

1.2.4 ?陳化煙葉免培養細菌多樣性分析 ?根據所擴增區域的特點，基于IonS5TMXL測序平臺，構建文庫。通過剪切、OTUs聚類，隨后進行物種注釋及豐度分析，揭示樣品物種構成;α多樣性分析（Alpha Diversity）揭示樣品之間的差異。

1.3 ?數據分析方法

采用生物信息學軟件PICRUST數據處理系統和Microsoft Excel 2010軟件對數據進行分析。

2 ?結 ?果

2.1 ?不同助分離劑對陳化煙葉細菌區系的分離效果

2.1.1 ?不同濃度SDS分離效果 ?由圖1可知，不加SDS處理分離獲得細菌總量為0.48×103 cfu/g。在分 離液中加入1‰的SDS溶液時分離效果最好，分離獲得細菌總量為2.83×103 cfu/g，比對照組分離獲得細菌總數提高約5倍（489.58%）。而其他濃度SDS溶液也有助于細菌總數的提高。

2.1.2 ?不同種類助分離劑分離效果 ?由圖2可知，不同助分離劑對分離獲得細菌總量影響極顯著，同對照相比，1‰ SDS效果最佳、次之為玻璃珠（細菌總數提高104.57%）以及1%吐溫20（細菌總數提高19.94%），而1% Trizol具有抑制細菌生長的作用，致使細菌總數低于對照組。

2.2 ?陳化煙葉可培養細菌鑒定

2.2.1 ?煙葉表面可培養細菌區系的菌落形態 ?培養12 h后，根據菌落的形態、顏色、大小等特征將群落分類、計數，統計結果見表2。由表2可知，菌落以圓形為主，菌落顏色主要為乳白色，部分為黃色，少量為無色，最大菌落直徑為4 mm，最小菌落直徑為1 mm。

2.2.2 ?煙葉表面可培養微生物區系的種屬鑒定 ?煙葉可培養細菌區系的菌種鑒定結果見表3。16個樣品經過16S rDNA序列基因比對后鑒定為6種菌，其中2和9號菌為克氏桿菌（Bacillus kochii），分離到的有效濃度為1×102 cfu/g;編號3，4，5，14為赫氏亞特蘭德桿菌（Atlantibacter hermannii），分離到的有效濃度為4.5×103 cfu/g;編號1，6，7，10，15為枯草芽孢桿菌（B. subtilis），分離到的有效濃度為1.5×103 cfu/g;編號11為蠟樣芽胞桿菌（B. cereus），分離到的有效濃度為50 cfu/g;編號8，12，13為B. aquimaris，分離到的有效濃度為6.84×102 cfu/g;編號16為B. megaterium，分離到的有效濃度為17 cfu/g。

6種菌分別屬于2個屬，即為芽孢桿菌屬（Bacillus）和亞特蘭桿屬（Atlantibacter），由此可見，該陳化時期的煙葉表面可培養微生物的優勢菌種類比較單一。

2.3 ?陳化煙葉細菌區系在不同培養基上的增殖效果

由表4可知，不同培養溫度下，隨著培養時間延長，經過LB培養基培養后，細菌區系的增殖數量最高，煙葉浸液培養基次之，細菌在PYGV培養基上不能生長。在15 ℃培養8 h，細菌區系經過LB培養基和煙葉浸液培養基培養后，其細菌種類數量略有降低，培養至12 h，經過LB培養基培養的細菌種類數量再次降低，而在37 ℃培養8 h和12 h，細菌種類數量降低了33.33%。

綜合而言，在優先保證促陳化菌種庫多樣性的前提下，在15 ℃使用煙葉浸液培養基培養12 h來培養煙葉細菌區系，總微生物的數量提高了100倍左右，增殖效果較好。

經鑒定，陳化煙葉細菌區系經煙葉浸液培養基培養后獲得5種菌（表5），即克氏桿菌（B. kochii）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、蠟樣芽胞桿菌（B. cereus）、B. aquimaris和赫氏亞特蘭德桿菌（A. hermannii），有效濃度依次為1.03×104、4.53×105、1.39×105、6×105以及7.2×104 cfu/g。該結果與擴增前種屬（表3結果）相比，擴增后未獲得菌B. megaterium，細菌量總數提高約100倍，而細菌相對豐度和多樣性無明顯變化。

2.4 ?陳化煙葉免培養和可培養細菌多樣性分析

2.4.1 ?OTUs聚類及物種注釋 ?表6所示，未經過增殖培養的陳化煙葉微生物Q.1經過宏基因測序得到的OTUs數目為91條，增殖培養之后的微生物H.1得到的OTUs數目為21條，這說明未經過增殖培養的陳化煙葉微生物具有較高的豐富度，增殖培養之后具有較低的豐富度。

2.4.2 ?群落結構分析 ?在門水平上，各物種相對豐度如圖3。由圖3可知，未經過增殖培養的陳化煙葉微生物（Q.1）群落在門分類水平上包括變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）以及少量的放線菌（Actinobacteria），培養之后的微生物（H.1）群落僅僅只包含變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。通過對比發現，變形菌門在樣品細菌群落中占據主導地位，為最優勢細菌。

2.4.3 ?群落功能相對豐度分析 ?根據數據庫注釋結果，選取每個樣本或分組在各注釋層級上最大豐度排名前10的功能信息，生成功能相對豐度柱狀堆積圖，如圖4所示。由圖4可知，未經過培養增殖的陳化煙葉微生物（Q.1）和培養增殖之后的微生物（H.1）群落功能相對豐度與比例沒有明顯的差異。陳化煙葉微生物的功能基因主要包括：與膜轉運相關的基因、碳水化合物代謝相關的基因、氨基酸代謝相關的基因、復制和修復相關的基因、與細胞過程和信號傳遞相關的基因、能量代謝相關基因、輔助因子和維生素代謝相關基因、翻譯相關基因、脂質代謝相關基因以及一些其他功能的相關基因。

3 ?討 ?論

本研究發現添加1‰ SDS分離K326陳化煙葉表面微生物區系的效果最好。SDS是離子型表面活性劑，本身所帶的電荷可以降低微生物與灰塵顆?；蛘咧参镏g的作用力，并且SDS具有良好的去污能力，可以溶解煙葉陳化過程中生成的油脂等黏性物質，從而有助于微生物的分離[16-17];Trizol主要成分是苯酚，作為提取RNA的裂解劑能夠使細胞的蛋白、核酸等物質得到釋放[18]，但是在提取過程中，Trizol也會使微生物發生死亡性裂解，導致微生物數量減少。吐溫20作為溶質的助懸劑，能夠中和化學試劑對微生物的抑制作用，但是其本身的不

飽和脂肪酸也十分容易氧化降解而產生多種有毒成分導致微生物數量減少[19]。玻璃珠在振蕩過程中能使微生物從煙葉表面分離下來，但是玻璃珠對細胞具有機械破碎作用，導致分離效率不高。此外，本研究僅對陳化煙葉表面的好氧細菌進行了分離，而對于陳化煙葉表面存在的厭氧菌值得在后續試驗中進行深入研究。

在不同培養溫度下，經過LB培養基培養之后，陳化煙葉細菌區系的豐度最高，煙葉浸液培養基次之，PYGV培養基最低;而經過煙葉浸液培養基培養之后，微生物的多樣性最高，LB培養基次之，PYGV 培養基最低。造成這種現象可能是：不同培養基的營養配比不同。有研究表明，營養豐富的培養基更有利于優勢菌的富集，但貧培養基有利于微生物多樣性的保持[20-21]。相比較而言，LB培養基營養最為豐富，煙葉浸液的營養成分次之，PYGV培養基營養最低，這一結果與其他報道也較為相似[22]，但是有些區別，造成這一區別的原因是PYGV培養基的營養非常匱乏，短時間內無法滿足不同細菌的快速增殖。

通過微生物可培養技術對陳化煙葉細菌區系的多樣性和豐度進行研究。結果表明，陳化煙葉細菌區系培養增殖前主要為芽孢桿菌屬和亞特蘭桿屬，這與其他學者的研究結果一致。浦紹占等[23]和韓錦峰等[24]發現，隨著陳化過程的進行芽孢桿菌屬逐漸成為優勢菌，培養增殖之后主要優勢菌是芽孢桿菌屬和亞特蘭桿屬，可以看出，在屬水平上，陳化煙葉細菌區系培養增殖前后細菌群落的多樣性無變化，從種水平上來看，陳化煙葉細菌區系培養增殖后與陳化煙葉細菌區系培養增殖前相比，也只缺失了Bacillus megaterium。

同時通過微生物免培養技術對陳化煙葉細菌區系的多樣性和豐度進行研究，發現雖然陳化煙葉培養增殖前后細菌區系的多樣性和豐度存在差異，但在代謝功能上卻沒有顯著差異。未經過培養增殖的陳化煙葉微生物群落在門分類水平上包括了變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）以及少量的放線菌（Actinobacteria），培養增殖之后的微生物群落僅僅只包含變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。變形菌門在樣品細菌群落中占據主導地位，為最優勢細菌，這與其他人的研究結果相似[13，25-26]。值得注意的是，本研究僅對有限的試驗樣品進行了分析，在后續試驗中應該采集不同地點的陳化煙葉進行研究，為試驗提供更完善的理論依據。

4 ?結 ?論

研究表明，以1‰ SDS為助分離劑相對于傳統方法對陳化煙葉細菌區系的分離率提高了489.58%。免培養分析表明，培養增殖前后的細菌區系組成存在一定差異，但其代謝功能并沒有顯著差異，培養增殖后的細菌區系仍然具備了原細菌區系的生理功能。使用煙葉浸液培養基培養可使煙葉表面可培養細菌增殖約100倍，并能較好地保留區系的多樣性。研究為合理利用微生物區系促進煙葉陳化提供了應用基礎。如何使微生物區系更完整地分離并在不影響其群落結構和功能完整性的前提下得到高效增殖，仍然值得進一步探索。分離和培養增殖的細菌在煙葉陳化過程中的應用也有待進一步驗證。

參考文獻

[1]郭曉奎. 人體微生物群與微生物組[J]. 微生物與感染，2017，12（3）：132-138.

GUO X K. Human microbiota and microbiome[J]. Journal of Microbes and Infections， 2017， 12（3）： 132-138.

[2]宋曉培，宋文靜，蘆偉龍，等. 不同硫酸鉀用量對植煙土壤細菌群落的影響[J]. 中國煙草科學，2019，40（1）：33-40.

SONG X P， SONG W J， LU W L， et al. Effects of different potassium sulfate levels on bacterial community of tobacco planting soil[J]. Chinese Tobacco Science， 2019， 40（1）： 33-40.

[3]李秀妮，李猛，萬德建，等. 煙葉微生物及其在煙葉發酵和醇化中的作用研究進展[J]. 微生物學通報，2019，46（6）：1520-1529.

LI X N， LI M， WAN J D， et al. Role of microorganisms in tobacco fermentation and alcoholization： a review[J]. Microbiology China， 2019， 46（6）： 1520-1529.

[4]LIU F， ZHAO Z， ZHAO M Q. Detection and quantitative analysis of dominant bacteria on aging flue-cured tobacco leaves[J]. Agricultural Science & Technology， 2016， 17（11）： 2611-2614.

[5]WANG J J， XU Z C， FAN J L. Effects of X-ray irradiation on the microbial growth and quality of flue-cured tobacco during aging[J]. Radiation Physics and Chemistry， 2015， 111： 9-13.

[6]薛磊，鄭澤浩，郭志剛，等. 煙草增香細菌的篩選及其作用效果[J]. 中國煙草科學，2019，40（5）：60-67.

XUE L， ZHENG Z H， GUO Z G， et al. Screening and application of aroma-enhancing bacteria for tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2019， 40（5）： 60-67.

[7]伍雪瑩. 陳化烤煙煙葉細菌群落鑒定及應用研究[D]. 廣州：華南理工大學，2014.

WU X Y. Identification and application study of bacterial communities on flue-cured tobacco leaves[D]. Guangzhou： South China University of Technology， 2014.

[8]關亮，李天麗，陳竹亭，等. 陳化煙葉中纖維素降解菌群的分離及其特性研究[J]. 中國煙草科學，2013，34（6）：103-107.

GUAN L， LI T L， CHEN Z T， et al. Isolation and characterization of

bacterial community with cellulose-decomposition ability from aging flue-cured tobacco leaves[J]. Chinese Tobacco Science， 2013， 34（6）： 103-107.

[9]張繼光，申國明，張久權，等. 煙草連作障礙研究進展[J]. 中國煙草科學，2011，32（3）：95-99.

ZAHNG J G， SHEN G M， ZHANG J Q， et al. Advance in continuous cropping problems of tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2011， 32（3）： 95-99.

[10]周家喜，喻理飛，張健，等. 煙葉陳化過程細菌群落演替特征[J]. 生態學報，2018，38（21）：7739-7748.

ZHOU J X， YU L F， ZHANG J， et al. Study on the characteristics of bacterial community succession in tobacco aging [J]. Acta Ecologica Sinica，2018，38（21）： 7739-7748.

[11]梅涌，姜興濤，劉輝. 煙葉陳化中的微生物多樣性及其對煙葉品質改良的研究進展[J]. 湖北農業科學，2017，56（20）：3801-3803.

MEI Y， JIANG X T， LIU H. The microorganism diversity of aged tobacco and effects on improvement of tobacco quality[J]. Hubei Agricultural Sciences， 2017， 56（20）： 3801-3803.

[12]吳光麗，孫瑋宏，董高峰，等. 云南復烤煙葉不同地點醇化過程中可培養真菌種群分析[J]. 中國煙草科學，2018，39（3）：66-72.

WU G L， SUN W H， DONG G F， et al. Analysis of the dominant fungal population of flue-cured tobacco leaves during aging from different locations of Yunnan[J]. Chinese Tobacco Science， 2018， 39（3）： 66-72.

[13]葉建斌，閆記，劉向真，等. 原煙復烤前后細菌種群變化研究[J]. 河南農業科學，2017，46（1）：154-159.

YE J B， YAN J， LIU X Z， et al. Study on change of bacteria populations of raw tobacco leaves before and after redrying[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences， 2017， 46（1）： 154-159.

[14]周家喜. 不同倉儲環境微生物群落對煙葉陳化品質的影響[D]. 貴陽：貴州大學，2017.

ZHOU J X. Effects of microbial communities on quality of tobacco leaves in different storage environments[D]. Guiyang： Guizhou University， 2017.

[15]倪紅梅. 云南曬黃煙煙葉調制過程中細菌種群變化研究[D]. 昆明：昆明理工大學，2015.

NI H M. The dynamic and diversity of cultivable bacteria during leaves process of Yunnan sun-cured tobacco[D]. Kunming： Kunming University of Science and Technology， 2015.

[16]吳麗云，倪輝，李鶴賓，等. 微泡菌屬ALW5褐藻膠裂解酶的酶學性質及酶解產物的抗氧化活性[J]. 中國食品學報，2016，16（6）：79-87.

WU L Y， NI H， LI H B， et al. Characterization of alginate lyase from microbulbifer sp. ALW5 and antioxidant activity of its hydrolysates[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology， 2016， 16（6）： 79-87.

[17]鄭鳳仙. 表面活性劑在固液界面及限制空間中的吸附和聚集行為的分子模擬研究[D]. 北京：北京化工大學，2009.

ZHENG F X. Molecular simulation study on adsorption and aggregation behaviors of surfactants in a solid liquid interface and confined space[D]. Beijing： Beijing University of Chemical Technology， 2009.

[18]CHAN K K， KWOK C S， SZE E T， LEE F W. Evaluation of the use of trizol-based protein extraction approach for gel-based proteomic analysis of dried seafood products and chinese tonic foods[J]. International journal of molecular sciences， 2018， 19（7）： 1998-2011.

[19]崔肖肖，趙素合，胡明翰，等. 吐溫20濃度對鞘氨醇單胞菌脫硫胎面膠的影響[J]. 應用與環境生物學報，2015，21（6）：1037-1043.

CUI X X， ZHAO S H， HU M H， et al. The influence of tween 20 concentration on biodesulfurization of ground tire rubber by Sphingomonas sp[J]. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology， 2015， 21（6）： 1037-1043.

[20]胡元森，李翠香，孫富林，等. 不同培養基組合提高土壤細菌可培養性的研究[J]. 微生物學報，2007，47（5）：882-887.

HU Y S， LI C X， SUN F L， et al. Improved culturability of soil bacteria using proper combination with various culturing medium[J]. Acta Microbiologica Sinica， 2007， 47（5）： 882-887.

[21]羅楚翔，彭建，楊歡，等. 煙草赤星病拮抗芽胞桿菌的篩選及培養基優化[J]. 中國煙草科學，2014，35（3）：50-55.

LUO C X， PENG J，YANG H， et al. Screening and medium optimization of antagonistic Bacillus against tobacco brown spot disease[J]. Chinese Tobacco Science， 2014， 35（3）： 50-55.

[22]李明源，王繼蓮. 新疆東帕米爾高原慕士塔格峰洋布拉克冰川雪冰及融水中可培養細菌多樣性分析[J]. 冰川凍土，2015，37（6）：1634-1641.

LI M Y， WANG J L. Culturable bacterial diversity in snow， ice and meltwater of the Yangbark Glacier， Muztag Ata[J]. Journal of Glaciology and Geocryology， 2015， 37（6）： 1634-1641.

[23]浦紹占. 不同倉儲條件對醇化煙葉品質的影響[D]. 昆明：昆明理工大學，2017.

PU S Z. The effect of different warehouse conditions on quality of aged tobacco[D]. Kunming： Kunming University of Science and Technology， 2017.

[24]韓錦峰，葉波平. 陳化發酵期間烤煙葉面微生物活性及其應用研究[J]. 中國煙草科學，1997，18（4）：13-14.

HAN J F，YE B P. Microbial activity and application of flue-cured tobacco leaf during aging[J]. Chinese Tobacco Science， 1997， 18（4）： 13-14.

[25] 王小花，黃鶯，陳雪，等. 植煙土壤高活性氨化菌的篩選鑒定及其氨化能力分析[J]. 中國煙草科學，2019，40（3）：31-38.

WANG X H， HUANG Y， CEHN X， et al. Screening， identification and ammoniation ability analysis of high activity ammonia bacteria in tobacco growing soil[J]. Chinese Tobacco Science， 2019， 40（3）： 31-38.

[26] 段玉琪，晉艷，陳澤斌，等. 烤煙輪作與連作土壤細菌群落多樣性比較[J]. 中國煙草學報，2012，18（6）：53-59.

DUAN Y Q， JIN Y， CHEN Z B， et al. Comparison of bacteria diversity between tobacco plantation soils of rotational cropping and continuous cropping[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2012， 18（6）： 53-59.

基金項目：云南中煙工業有限責任公司項目“提高云南中煙煙葉可用性的研究和應用”（2015YL0）;“煙葉生物工程技術綜合利用聯合實驗室-煙

用生物酶制劑開發研究”（S-6013067）

作者簡介：殷 ?爽（1995-），男，碩士研究生，從事煙草微生物生態與應用研究。E-mail：448148935@qq.com。*通信作者，E-mail：homework18@126.com

收稿日期：2019-08-26 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 修回日期：2020-02-12