Cams1基因在煙草上的同源克隆及生物信息學分析

趙婷婷 陳倩 夏志林 王軍 喻奇偉 王磊 聶瓊 劉洋 劉仁祥

摘 ?要：為拓寬煙草不育基因的來源，依據辣椒雄性不育基因Cams1序列，在煙草品種K326中同源克隆獲得基因Ntms1，采用生物信息學方法對辣椒Cams1基因和煙草Ntms1基因的核苷酸序列、蛋白質結構、親疏水性及結構域等進行分析，并利用CRISPR/Cas9技術對Ntms1基因功能進行了驗證。結果表明，Cams1基因和Ntms1基因的蛋白質序列相似度為85.25%，基因編碼產物具有相同的PHD功能結構域，都具有磷酸化識別位點，有相似的二級和三級蛋白質結構，且兩個基因都沒有信號肽和跨膜區的結構，推測煙草Ntms1基因與辣椒不育基因Cams1具有相似的控制育性功能。遺傳轉化結果表明，突變株的Ntms1基因表達量和有活力花粉量極顯著低于野生型植株，證明了煙草Ntms1基因具有控制煙草花粉育性功能。

關鍵詞：煙草;雄性不育;ms1基因;生物信息學;遺傳轉化

Homologous Cloning and Bioinformatics Analysis of Gene Cams1 in Tobacco

ZHAO Tingting1， CHEN Qian1， XIA Zhilin2， WANG Jun2， YU Qiwei3， WANG Lei1，

NIE Qiong1， LIU Yang1， LIU Renxiang1*

（1. College of Tobacco， Guizhou University， Guizhou Key Laboratory for Tobacco Quality Research， Guiyang 550025， China;

2. Zunyi Tobacco Company， Zunyi， Guizhou 564000， China; 3. Bijie Tobacco Company， Bijie， Guizhou 551700， China）

Abstract： To broaden the source of tobacco sterility genes， based on the capsicum male sterility gene Cams1 sequence， the gene Ntms1 was homologously cloned in tobacco variety K326. Bioinformatics method was employed to analyze the nucleotide sequence， protein structure， hydrophilicity and domain of Capsicum gene Cams1 and tobacco gene Ntms1， and the function of Ntms1 was verified by using CRISPR/Cas9 technique. Results showed that the protein sequence similarity of Cams1 and Ntms1 reached 85.25%， with the products encoded by the two genes having same PHD functional domain， same phosphorylation recognition site， similar secondary and tertiary protein structures， and the two genes had no signal peptide and transmembrane structure. It was speculated that tobacco Ntms1 gene and pepper sterile gene Cams1 had similar function of fertility control. The results of genetic transformation showed that the expression of Ntms1 and the amount of active pollen in the mutant were highly significantly lower than that in the wild type， which proved that Ntms1 had the function of tobacco pollen fertility control.

Keywords： tobacco; male sterility; ms1 gene; bioinformatics; genetic transformation

植物雄性不育（male sterility，MS）是指植物雄性生殖器官發育異常而營養生長及雌性生殖器官發育都正常的現象[1]，在作物育種和分子生物學研究中具有重要作用[2]。利用雄性不育生產雜交種，可省去人工去雄，降低制種成本、提高種子純度。

煙草生產的收獲物是葉片，為了控制品種布局及實現煙葉定位生產，除利用不育雜交種外，往往也將雜交選育的純系品種轉育成不育系在生產上利用。目前，煙葉生產上利用的不育系來源單一，僅有來源于N.suaveolens的胞質不育基因成功利用，導致煙草雜交種和不育系的生產應用存在極大風險，因此，不育性的研究對于煙草極為重要。在煙草雄性不育性的研究中，前人多集中在不育胞質基因的研究上，發現了atp6、atp9、orf25以及orfB等不育胞質基因，而煙草不育核基因研究較少[3]，李勝國等[4]、SCHMULLING等[5]、耿颯等[6]利用轉基因技術構建出MS系煙草，但未報道控制煙草育性的細胞核基因;擬南芥[7]、玉米[8]、水稻[9]等作物雄性不育的研究，獲得了多個控制作物不育性的核基因。ZOE[7]等發現，擬南芥ms1突變體在早期發育階段都表現正常，在小孢子釋放階段，小孢子的細胞質和絨氈層開始出現異常液泡化和降解，導致成熟花粉囊中沒有活性花粉粒。擬南芥ms1突變體能夠導致花粉敗育，而對其他器官的生長發育沒有不良影響[10]，具有較大的生產應用價值;KYUMI等[11]在辣椒上發現了一個和擬南芥中ms1基因高度同源的雄性不育基因Cams1（登錄號CA05g06780）。為了拓寬煙草不育性的來源，本研究通過同源克隆方法，根據辣椒Cams1基因序列，從煙草中同源克隆出Ntms1基因，運用生物信息學和CRISPR/Cas9基因編輯技術對該基因功能進行分析，對于促進煙草雄性不育性的研究及拓寬煙草不育性的來源有較為重要的科學意義和實踐價值。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

1.1.1 ?植物材料與遺傳轉化培養基 ?試驗所用烤煙品種K326由貴州省煙草品質研究重點實驗室提供。遺傳轉化所用培養基配方參照文獻[13]。

1.1.2 ?載體與菌株 ?本試驗所采用的大腸桿菌Escherichia coli菌株DH5α，農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105均由貴州省煙草品質研究重點實驗室保存并提供;克隆載體pMD18-T vetor T由陜西博瑞德生物科技有限公司提供;CRISPR/Cas9重組載體MSG2靶點設計與比對在貴州省煙草品質研究重點實驗室完成，CRISPR/Cas9重組載體合成由百格基因科技（江蘇）有限公司完成。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?總RNA提取及cDNA合成 ?采用RNAiso Plus Tri Zol（Ta Ka Ra）提取總RNA。采用Poly A Ttract? mRNA Isolation System Ⅲ with Magnetic Stand（Promega）試劑盒合成cDNA，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2.2 ?普通煙草Ntms1的PCR擴增及克隆 ?從NCBI網站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得辣椒ms1蛋白的氨基酸序列Cams1，用此氨基酸序列與普通煙草進行比對，找到與之同源性較高的類ms1蛋白，以其氨基酸序列獲得煙草中ms1基因的序列（GenBank登錄號為LOC107813657），用此序列在Primer6.0軟件中設計特異性引物657-F（ATGGTGGTAATGAATGGAAGGCC）/657-R（TCA

GGCAGCATTAGTCAAGC），以普通煙草K326品種的葉片cDNA為模板，擴增LOC107813657基因的CDS序列，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶連接到T載體，送往陜西博瑞德生物科技有限公司測序，并將序列命名為Ntms1。

1.2.3 ?生物信息學分析 ?利用NCBI中的ORF （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）確定辣椒Cams1及煙草Ntms1基因編碼蛋白質的開放閱讀框;ProtParam系統（https：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質等電點（PI）、消光系數及不穩定系數等理化性質;Protscale（https：//web.expasy.org/protscale/）預測蛋白質的親疏水性;Inter-Pro（http：//www.ebi. ac.uk/interpro/）分析蛋白質結構域;NetPhos 3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析蛋白質磷酸化位點;SOPMA分析和預測蛋白質的二級結構;Phyre2分析預測蛋白質的三級結構;TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析蛋白質的跨膜結構域。Signal P4.1 分析蛋白質是否含有信號肽;DNAMAN 軟件對蛋白質序列進行相似性比對;MEGA7.0 軟件構建分子進化樹。

1.2.4 ?煙草Ntms1的功能驗證 ?（1）遺傳轉化：采用農桿菌介導[14]的煙草葉片遺傳轉化法。

（2）陽性植株篩選：以提取轉化植株DNA為模板，用Cas9載體序列特異引物Cas9-F（CACCAT CTACCACCTGAGAA）/Cas9-R（CGAAGTTGCTCT TGAAGTT）及潮霉素抗性基因特異引物HYG-F（CTCGTGCTTTCAGCTTCGATGT）/HYG-R（TGT CGTCCATCACAGTTTGCCA），對轉化植株進行篩選。

（3）陽性植株基因測序：設計引物Ntms1-1F（TCCTACAAATAGGCTCCGAGA）/Ntms1-1R（TGCACGATTTGCACCTAGAC），以轉化陽性單株DNA為模板擴增靶位點序列，對PCR產物進行測序。

（4）突變植株Ntms1基因表達量分析：以反轉錄的cDNA為模板，根據Ntms1序列設計熒光定量PCR引物PHD_F（ATGTTGGCTTGTGATGT CTG）/ PHD_R（TTCCCGCTTGTATTTGTAGTC），以煙草Actin內參基因引物Actin-F（CATGAAGATTAA

AGGCGGAGTG）/Actin-R（AACAGTTTGGTTGGA GTTCTGG）進行Ntms1基因表達量分析。

（5）突變植株花粉活力鑒定：盛花期時取即將成熟開裂的花藥，解剖針去除花藥壁，挑出全部花粉，經200 ?L碘鉀（I-KI）染色液染色混勻后，在顯微鏡（40×）下觀察花粉形態及染色情況，每株植株隨機選取5個視野，計算染色花粉數量。

2 ?結 ?果

2.1 ?目的基因的擴增及克隆

單菌落PCR方法陽性克隆鑒定結果（圖1）顯示，有與目的基因條帶大小一致的條帶，說明克隆成功。

2.2 ?煙草Ntms1生物信息學分析

2.2.1 ?開放閱讀框分析 ?對基因的開放閱讀框進行定位，辣椒Cams1起始密碼子位于第1個核苷酸，終止密碼子位于第2100個核苷酸，共編碼699個氨基酸;煙草Ntms1起始密碼子位于第36個核苷酸，終止密碼子位于第2174個核苷酸，共編碼712個氨基酸;兩個基因編碼區相互重疊，編碼氨基酸數量相差極小，說明兩個基因編碼的蛋白質差異不大。

2.2.2 ?理化性質分析 ?從理化分析結果（表1）看出，兩個基因各理化性質指標都極為接近。

2.2.3 ?蛋白比對 ?相似性比對結果得出Cams1基因和Ntms1基因編碼的蛋白質相似度為85.25%，氨基酸序列有較高的相似度（圖2）。

2.2.4 ?親疏水性分析 ?親疏水性（圖3）分析初步認為兩種蛋白質均具有較強的親水性。

2.2.5 ?功能結構域分析 ?結構域分析結果所示，Cams1、Ntms1基因編碼產物都具有相同的PHD結構域。

2.2.6 ?二級結構及三級結構預測 ?對蛋白質的二級結構（表2）和三級結構分析，結果可以看出二者空間結構相似度很高。

2.2.7 ?磷酸化位點分析 ?磷酸化位點分析結果顯示，Cams1、Ntms1都是具有蛋白激酶活性的受體。

2.2.8 ?信號肽及跨膜區分析 ?信號肽分析預測顯示，Cams1、Ntms1蛋白都無信號肽序列特征，由此預測兩者均為非分泌蛋白。進一步對跨膜區域進行預測發現，Cams1、Ntms1蛋白都不存在跨膜區，均為非跨膜蛋白。

2.2.9 ?系統進化樹分析 ?在NCBI網站上選取具有雄性不育功能的物種進行進化樹分析，結果所示（圖4），Cams1、Ntms1親緣關系比較近。

經過生物信息學初步分析，Cams1、Ntms1二者基因結構及編碼的蛋白質性質差異極小，可以初步推測煙草Ntms1可能與辣椒Cams1具有相同的控制育性的功能。

2.3 ?煙草Ntms1基因突變效應分析

2.3.1 ?陽性植株篩選 ?對轉化植株進行Cas9基因及HYG潮霉素基因進行PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，均擴增出與預期產物大小相同的目的條帶（圖5），說明Cas9基因已經進入植株體內。

2.3.2 ?陽性植株目的基因測序 ?對獲得的轉化陽性植株用靶點檢測引物對靶點上下游區域進行PCR 擴增，并將擴增產物進行測序分析，結果表明，6株陽性植株均發生了編輯（圖6）。

2.3.3 ?突變植株基因表達分析 ?RNA質量檢測結果顯示（圖7），將其逆轉錄為cDNA，并分別用煙草內參基因和Ntms1基因熒光定量引物對所得cDNA進行PCR檢測，條帶指示的大小與預期大小一致。

對6株突變植株進行基因表達量分析，結果如圖8所示，6株突變株的Ntms1基因表達量較野生型均發生不同程度的降低，統計分析結果顯示，與野生型植株相比，突變株目的基因相對表達量均達到了極顯著差異，進一步說明CRISPR/Cas9載體在煙草植株體內對目的基因發揮了作用，導致目的基因在表達水平上發生改變，產生了突變效應。

2.3.4 ?突變植株花粉活力鑒定 ?有活力花粉數量和花粉活力是鑒定育性最直接的指標，突變植株花粉數量和花粉活力鑒定結果顯示（表3，圖9），每視野下突變株花藥中有活力花粉數量極顯著低于野生型，說明Ntms1基因具有控制煙草育性的作用;由圖9看出，突變株花粉粒染色后顏色均呈淡黃色，較野生型花粉粒顏色淺，表明突變株中有活力花粉粒的數量較野生型低。

3 ?討 ?論

雜種優勢是生物界的一種普遍現象，也是提高作物產量和品質的重要育種途徑，水稻和玉米雜交種的大面積利用對我國乃至世界糧食增產和安全作出了巨大貢獻[16]。生產上要使用雜交種，就必須年年制種，制種過程中人工去雄不僅浪費人力，且容易因去雄不徹底導致種子不純，影響生產[15]。利用雄性不育系制種，可以省去人工去雄環節，既降低種子生產成本，又提高制種質量，因此，不育系的選育對作物雜種優勢研究利用極為重要。

利用生物信息學方法對基因序列進行分析，可以發掘基因信息，預測基因的生物學功能，提高基因功能鑒定的效率[16]。在煙草基因組中，生物信息學分析能夠進行遺傳圖譜構建、轉錄數據分析等[17]。周輝[18]等利用生物信息學方法分析了大腸桿菌HspQ基因;張長靜[20]等運用生物信息學方法分析了煙草雄性不育系及保持系的sdh3、sdh4基因在其核苷酸、編碼蛋白各結構層次上存在的差異。辣椒與煙草同為茄科作物，基因可能具有一定的相似性，本研究通過生物信息學方法對Ntms1基因編碼蛋白質序列的理化性質、信號肽、跨膜結構域、親疏水性、二級結構、三級結構等進行預測分析，其結果為研究Ntms1基因及其編碼產物的結構和功能提供了更多的信息。

基因編輯技術是一種能精確修飾生物體基因組特定目標基因的一種基因工程技術，其中基因敲除是鑒定基因功能最直接的方法[20-21]。常愛霞等[22]通過構建重組載體轉化煙草得到早花植株;在對Cams1基因的研究中，KYUMI等[12]表明，Cams1基因具有控制花粉育性的功能，具體表現為與可育植株相比，不育辣椒植株花粉量明顯降低;而在對辣椒核不育基因的研究中，DASKALOFF等[23]也發現了不育植株中花粉敗育的現象。本研究構建ms1基因敲除載體后進行遺傳轉化，陽性植株的基因表達量及有活力花粉數均極顯著低于野生型植株，與前人在辣椒上的研究結果一致，進一步說明煙草上ms1基因同樣具有控制育性的功能。通過進一步對本研究獲得的部分不育植株的自交篩選，育成煙草新不育系，可能對拓寬煙草制種的不育性來源有非常重要的實踐意義。

4 ?結 ?論

本研究采用生物信息學分析方法，以辣椒不育基因Cams1為模板，在煙草品種K326中克隆出序列Ntms1，結果表明Cams1和Ntms1基因編碼產物具有相似的結構，由此預測Ntms1與辣椒不育基因Cams1具有相似的控制育性功能。通過基因編輯技術，以農桿菌介導的方法將辣椒ms1基因轉入烤煙品種K326后獲得了6株陽性突變植株。與野生型對照植株比較，突變株ms1基因表達量極顯著降低，有活力花粉數極顯著低于野生型植株，最終獲得了部分不育植株，對于促進煙草雄性不育性的研究有較為重要的科學意義和實踐價值。

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基金項目：貴州省高層次創新型人才培養計劃——百層次人才{黔科合平臺人才[2016]5663號};貴州省煙草公司重大專項“優質烤煙品種選育關鍵技術研究與品種選育”（黔煙科201602）;貴州省煙草公司遵義市公司項目“遵義煙區烤煙品種篩選布局與后備品種選育研究”{遵煙計[2016]07號}

作者簡介：趙婷婷（1996-），女，在讀碩士研究生，研究方向：作物遺傳育種。E-mail：ttzhao5153@qq.com。*通信作者，E-mail：rxliu@gzu.edu.cn

收稿日期：2019-09-06 ? ? ? ? ? ? ? ?修回日期：2019-12-16