煙草赤星病菌對菌核凈和苯醚甲環唑的抗藥性檢測

陳長卿 王潤林 姜云 牛俊軻 閆東 苗成琪 高潔 趙雪 田馨月 張小蕊

摘 ?要：為了解吉林省和黑龍江省煙草赤星病菌對菌核凈和苯醚甲環唑的抗性水平，采用菌絲生長速率法，測定了318株煙草赤星病菌對菌核凈和苯醚甲環唑的藥劑敏感性，建立敏感基線。運用最低抑制濃度法確定抗性菌株及頻率，并比較不同采樣地點的抗性水平。結果表明，供試敏感菌株對菌核凈的敏感性頻率分布呈連續的單峰曲線，接近正態分布，其EC50均值2.916 μg/mL可作為兩省煙草赤星病菌對菌核凈的敏感基線，抗性頻率為21.38%;煙草赤星病菌對苯醚甲環唑的敏感基線為1.198 μg/mL，抗性頻率為18.24%。吉林省和黑龍江省煙草赤星病菌對菌核凈和苯醚甲環唑產生了不同程度的抗性，不同地點抗性水平存在差異。本研究為煙草赤星病菌的抗藥風險評估奠定了基礎，為制定吉林和黑龍江兩省煙草赤星病科學防治策略和科學用藥提供了依據。

關鍵詞：煙草赤星病菌;抗藥性;菌核凈;苯醚甲環唑

Resistance Assessment of Alternaria alternata Causing Tobacco Brown Spot to Dimethachlon and Difenoconazole

CHEN Changqing， WANG Runlin， JIANG Yun， NIU Junke， YAN Dong， MIAO Chengqi， GAO Jie*，

ZHAO Xue， TIAN Xinyue， ZHANG Xiaorui

（Jilin Agricultural University， Jilin 130118， China）

Abstract： To understand the resistance level of Alternaria alternata to dimethachlon and difenoconazole in Jilin and Heilongjiang Provinces， the sensitivity of 318 isolates of A. alternate to the two fungicides was determined by the method of mycelial growth rate and the sensitivity baseline to dimethachlom and difenoconazole were established. The resistant isolates and frequency were determined using the method of minimum inhibitory concentration and the levels of resistance risk of different locations were also evaluated. The results showed that the distribution of sensitivity frequency of isolates was a continuous single peak curve， which was close to the normal distribution. Therefore， the average value of EC50 with 2.916 μg/mL could be used as the sensitivity baseline of A. alternata to dimethachlon in both provinces and the resistance frequency was 21.38%. The sensitivity baseline of A. alternata to difenoconazole was 1.198 μg/mL and its resistance frequency was 18.24%. There was different resistance for the isolates to dimethachlon and difenoconazole between Jilin Province and Heilongjiang Province， and the resistance level in each regions was different. This study would lay the foundation of the resistance risk assessment and provide evidence to develop a scientific strategy to control tobacco brown spot disease in Jilin and Heilongjiang Provinces.

Keywords： Alternaria alternata; fungicide resistance; dimethachlon; difenoconazole

煙草赤星病（Tobacco brown spot）是由鏈格孢菌（Alternaria alternate）引起的煙草主要葉部病害，也是常發性葉部病害，在世界各地均有發生[1]，具有潛育期短、間歇性爆發流行的特點，不僅在收獲期前煙田發生，而且能在煙葉進入烤房后繼續發展危害[2]，危害嚴重時減產可達50%以上，是煙草安全生產的嚴重威脅和優質煙生產的一大障礙[3]。目前化學防治在煙草赤星病防治中仍是一種重要手段，尤其在生物菌劑預防效果不理想的情況下，化學藥劑作為重要的應急措施發揮了關鍵作用。菌核凈在上世紀70年代開始應用于煙草赤星病的防治[4]，目前仍是防治煙草赤星病的主推藥劑[5]。然而，由于菌核凈在生產上的長期大量使用以及使用的不合理，已導致抗藥菌株的產生，云南、貴州等地已有煙草赤星病菌抗藥性的報道[6-7]。苯醚甲環唑屬三唑類殺菌劑，具有良好的內吸性，殺菌譜廣，能夠通過抑制麥角甾醇的生物合成而干擾病菌的正常生長，對子囊菌綱、擔子菌綱、無性孢子類具有較好的抑制效果[8]。陳杰等[9]報道10%苯醚甲環唑水分散粒劑對煙草赤星病的防效達到90.60%，是近年來用于防治赤星病等葉斑病的特效藥劑。吉林省和黑龍江省是我國重要的煙葉生產基地，也是赤星病的重災區和菌核凈頻用地區。但目前關于吉林省和黑龍江省煙區煙草赤星病菌對菌核凈和苯醚甲環唑的抗藥性水平尚未明確。為此，本研究針對兩省煙區的煙草赤星病菌開展了2種藥劑的抗藥性檢測分析，以期為兩省該病原菌的抗性風險評估提供理論依據，為制定有效的藥劑防治策略奠定基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試菌株：2017年7—9月在吉林省13個煙草種植鄉鎮和黑龍江省7個鄉鎮采集具有煙草赤星病典型癥狀的葉片，通過單孢分離方法，共獲得菌株318株，其中吉林省175株，黑龍江省143株，菌株來源詳見表1。

供試殺菌劑：93%菌核凈原藥和96%苯醚甲環唑原藥均由武漢遠程共創科技有限公司生產。

含藥培養基的制作：93%菌核凈原藥和96%苯醚甲環唑原藥用甲醇溶解，配成104 μg/mL母液，4 ℃貯藏備用。使用時將母液用無菌水分別稀釋配制成質量濃度分別為0.001、0.01、0.1、1、10、100 μg/mL的系列濃度，以10%藥液量加入滅菌且溶化

狀態的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基（冷卻至45～50 ℃）中充分搖勻，制成含藥平板。

1.2 ?方法

1.2.1 ?煙草赤星病的敏感性測定 ?采用菌絲生長速率法[10]。將供試菌株接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基平板上，28 ℃恒溫培養7 d后，制成直徑為8.0 mm的菌餅，且將菌餅分別接種到1.1中配置的含藥平板中央，每個處理重復3次，28 ℃恒溫培養，以不含藥平板為空白對照，7 d后采用十字交叉法測量各處理的菌落直徑，根據公式（1）計算抑菌率：

抑菌率/%=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100 ? ? ? ? ? ?（1）

采用Excel 2013和SPSS 22統計軟件對數據進行處理與分析。以菌絲生長抑制率的幾率值為y坐標，藥劑濃度的對數值為x坐標，計算毒力回歸方程y=a+bx及有效抑制中質量濃度EC50值。運用最低抑制濃度法[11]鑒別敏感菌株并對敏感菌株進行正態檢驗，以每個敏感菌株EC50值的對數值為橫坐標，菌株分布頻率為縱坐標，繪制敏感性頻率分布柱狀圖。當病原菌群體的EC50值頻率呈正態分布時，可將該群體的EC50均值作為病原菌對藥劑的敏感基線[8，12]，采用Shapiro-Wilk法對EC50值進行正態分布檢驗：p>0.05則符合正態分布，反之則為非正態分布。

1.2.2 ?抗藥性水平的劃分 ?抗藥性水平的劃分參照席亞東等[13]的方法，測定菌株的抗性倍數，如公式（2）：

抗性倍數=測定菌株的EC50/敏感基線 ?（2）

根據抗性倍數將供試菌株劃分為敏感、低抗、中抗和高抗菌株，標準如下：

敏感：抗性倍數≤5

低抗：5<抗性倍數≤10

中抗：10<抗性倍數≤100

高抗：抗性倍數>100

根據抗藥性菌株在群體中的出現頻率計算出抗藥性菌株頻率，如式（3）：

抗性菌株頻率/%=抗性菌株/供試菌株×100

（3）

2 ?結 ?果

2.1 ?煙草赤星病菌對菌核凈和苯醚甲環唑的敏感性和敏感基線

如圖1A所示，318株供試菌株對菌核凈的敏感性呈連續性分布，其中EC50最小值為0.0075 μg/mL，最大值為430.47 μg/mL。運用最低抑制濃度法鑒定獲得敏感菌株97株，對敏感菌株的EC50值取對數，采用Shapiro-Wilk法分析得知p=0.125>0.05，表明煙草赤星病菌對菌核凈的敏感性頻率呈近似正態分布。因此，其EC50均值（2.916±0.231） μg/mL可作為煙草赤星病菌對菌核凈的敏感基線。

318株供試菌株對苯醚甲環唑的敏感性呈連續性分布（圖1B），其中EC50最小值為0.0046 μg/mL，最大值為637.86 μg/mL。運用最低抑制濃度法鑒定獲得敏感菌株232株，對敏感菌株EC50值取對數，采用Shapiro-Wilk法分析得知其p=0.08>0.05，表明病原菌對苯醚甲環唑的敏感性頻率呈近似正態分布。因此，其EC50均值（1.198±0.122） μg/mL可作為煙草赤星病菌對苯醚甲環唑的敏感基線。

2.2 ?吉黑兩省煙草赤星病菌對菌核凈的抗性頻率及分布

吉林省煙草赤星病菌對菌核凈敏感菌株139株，抗性菌株36株，抗性頻率為20.57%，其中低抗菌株占8.64%，中抗菌株占10.23%，高抗菌株為1.70%（表2）。不同采樣地點抗性頻率有一定差異，其中白城市平安鎮菌株對菌核凈抗性頻率最低為0，大安市叉干鎮和洮南市黑水鎮的菌株對菌核凈抗性頻率最高，達到42.86%。

黑龍江省煙草赤星病菌對菌核凈敏感菌株111株，抗性菌株32株。抗性頻率22.38%，高于吉林省抗性頻率，其中低抗頻率13.99%，中抗頻率7.69%，高抗頻率0.70%（表3）。煙草赤星病菌株對菌核凈的抗藥性以低抗和中抗水平為主，高抗菌株較少。不同采樣點之間抗藥性存在差異，哈爾濱市常安鎮抗性頻率最高為37.5%，而肇東市黎明鎮尚未檢測到抗藥性，抗性頻率為0%。

2.3 ?吉黑兩省煙草赤星病菌對苯醚甲環唑的抗性頻率及分布

吉林省煙草赤星病菌對苯醚甲環唑敏感菌株149株，抗性菌株26株，抗性頻率為14.86%，低于對菌核凈的抗性頻率，其中低抗菌株占6.14%，中抗菌株4.65%，高抗菌株4.07%（表4）。不同采樣點之間抗性菌株頻率差異較大，大安市舍力鎮抗藥性最高，抗性頻率達85.71%，大安市叉干鎮和龍井市三合鎮未檢測到抗性菌株。

黑龍江省煙草赤星病菌對苯醚甲環唑敏感菌株111株，抗性菌株32株，抗性頻率22.38%，高于吉林省抗性頻率，其中低抗頻率8.81%，中抗頻率5.71%，高抗頻率7.86%（表5）。不同采樣點之間抗性頻率有明顯差異，其中哈爾濱市常安鎮抗性頻率最高達64.29%，大慶市肇州鎮和哈爾濱市寧遠鎮未檢測出抗藥性菌株。與表3相比，苯醚甲環唑在黑龍江省整體抗性頻率高于菌核凈，高抗頻率是菌核凈的11.73倍，低抗和中抗頻率低于菌核凈。

2.4 ?不同地點煙草赤星病菌對兩種藥劑的抗性比較分析

如圖2所示，黑龍江省大慶市肇州鎮、哈爾濱市寧遠鎮和吉林省大安市叉干鎮、龍井市三合鎮煙草種植區檢測出對菌核凈有中高抗性菌株群體，而對苯醚甲環唑未檢測到抗性菌株;龍江肇東市黎明鎮和吉林省白城市平安鎮對菌核凈無抗藥性菌株出現;黑龍江省大慶市永勝鄉、哈爾濱市常安鎮、寧安市寧安鎮和吉林省和龍市頭道鎮、洮南市黑水鎮、延邊州汪清鎮、德惠市大房身鎮、大安市舍力鎮、延吉市依蘭鎮檢測出對菌核凈和苯醚甲環唑均有中高抗性菌株群體;吉林省通化市柳河鎮、松原市弓棚子鎮、延邊州萬寶鎮檢測出少數對兩種藥劑均產生中低抗性的菌株。

3 ?討 ?論

本研究測定了吉林省和黑龍江省20個煙草主要種植鄉鎮的煙草赤星病菌對菌核凈和苯醚甲環唑的敏感性，并建立了敏感基線，研究發現吉林省和黑龍江省赤星病菌對菌核凈已經產生了抗藥性群體，抗性菌株頻率21.38%，個別地點抗藥性頻率偏高，大安市叉干鎮的抗性頻率達42.86%，哈爾濱市常安鎮抗性頻率達37.5%。本試驗所獲得的吉黑兩省煙草赤星病菌對菌核凈的抗性菌株頻率均低于云南省[6]和貴州省[7]水平。張彬彬等[14]報道山東省田間煙草赤星病菌對苯醚甲環唑保持較高的敏感性，未出現敏感性降低的亞群體。本研究率先進行了煙草赤星病菌對苯醚甲環唑的抗藥性檢測，發現吉黑兩省煙草赤星病菌對苯醚甲環唑的敏感基線為1.198 μg/mL，抗性頻率分別為14.86%和22.38%，低于菌核凈的相應指標，但已經出現了抗藥性群體。不同地點菌株群體對2種藥劑的抗性水平存在差異，本試驗開展赤星病菌抗性風險評估和交互抗性等研究，為推薦合理用藥奠定了基礎。例如，病原菌對菌核凈和苯醚甲環唑以中高抗性水平為主的地區應該減少繼續使用兩種藥劑，篩選和開發新的有效防治煙草赤星病菌的藥劑，低抗水平地區可以交替用藥，對其中一種有抗性的地區可以采用替代藥劑進行防治等。

近年來，經過煙草行業科研工作者不懈努力和深入研究，對煙草赤星病的防治取得了較大進步。但由于該病原菌生理小種多變，氣候環境異常，缺少高抗品種等因素影響，使得此病的發生呈逐年上升趨勢[15]。為更好地可持續防治煙草赤星病，減少抗藥性產生，查明地區抗性差異的形成因素尤為重要。此外，病原菌抗藥性的產生也可能與農耕條件、氣候條件、施藥方式、施藥種類和施藥量等多因素有關。因此，防治煙草赤星病需要加強抗病品種選育利用、農業栽培措施的管理，定期做好抗性監測工作，注意藥劑的交替和輪換使用。

4 ?結 ?論

本研究明確了吉林省和黑龍江省煙草赤星病菌對菌核凈和苯醚甲環唑的敏感性，確定了敏感基線。不同地點菌株群體對兩種藥劑的抗性水平存在著一定的差異，根據低中高抗性頻率，可為生產上防治該病害提出科學合理用藥建議和要求，避免和降低抗藥性的產生，有效防治病害。

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基金項目：吉林省煙草公司煙草綠色防控重大專項“吉林省煙草有害生物綠色防控技術的創新、集成與示范”（2017220000270029）

作者簡介：陳長卿（1978-），男，副教授，博士、碩士生導師，主要從事植物病害綜合防治。E-mail：ccqjy@163.com

*通信作者，E-mail：jiegao115@126.com

收稿日期：2019-08-17 ? ? ? ? ? ? ? 修回日期：2019-11-17