血清4-羥基壬烯醛、人軟骨糖蛋白-39、腎損傷分子-1診斷早期糖尿病腎病的臨床意義研究

余世紀 蘇曉清 王桂良

[摘要]目的 探討血清4-羥基壬烯醛（4-HNE）、人軟骨糖蛋白-39（YKL-40）、腎損傷分子-1（KIM-1）在糖尿病腎病（DN）早期腎損傷中的臨床價值，并分析4-HNE、YKL-40、KIM-1與腎損傷指標、血糖水平、血脂水平的相關性。方法 選取2019年1～7月萍鄉市人民醫院內分泌科收治的89例2型糖尿病（T2DM）患者，根據24 h尿蛋白排泄率（UAER）結果分為正常蛋白尿組/單純糖尿病組（NA組）、微量蛋白尿組（MI組）和大量蛋白尿組（MA組）。另選萍鄉市人民醫院體檢科的53例健康體檢者作為健康對照組（NC組）。采用酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測各組血清中的4-HNE、YKL-40、KIM-1濃度。結果 MA組的血清4-HNE、YKL-40、KIM-1高于MI組，差異有統計學意義（P<0.05）;MI組的血清4-HNE、YKL-40、KIM-1高于NA組，差異有統計學意義（P<0.05）;NA、MI、MA組的血清4-HNE、YKL-40、KIM-1均高于NC組，差異有統計學意義（P<0.05）。NA、MI、MA組患者的空腹血糖（FPG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、血清肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）、UAER均高于NC組，差異有統計學意義（P<0.05）;相關性分析顯示，SCr、尿微量蛋白（UmALB）、UAER、FPG、HbA1c與4-HNE、YKL-40、KIM-1成正相關（r=0.428、0.349、0.390，0.501、0.446、0.491，0.478、0.409、0.461，0.414、0.502、0.497，0.584、0.558、0.607;P<0.05）;BUN與4-HNE、YKL-40成正相關（r=0.223、0.176，P<0.05）;低密度脂蛋白（LDL）與4-HNE、YKL-40、KIM-1成負相關（r=-0.169、-0.289、-0.247，P<0.05）。結論 血清4-HNE、YKL-40、KIM-1可作為DN早期診斷的敏感指標，有望為臨床中DN的診斷提供依據;血清4-HNE、YKL-40、KIM-1與腎損傷指標、血糖水平成正相關。

[關鍵詞]糖尿病腎病;尿白蛋白;脂質過氧化;氧化應激;生物標志物

[Abstract] Objective To investigate the clinical value of serum 4-hydroxynonenal （4-HNE）， serum human chondroglycoprotein-39 （YKL-40） and kidney injury molecule 1 （KIM-1） in early renal injury of diabetic nephropathy （DN）， and to analyze the correlation of 4-HNE， YKL-40 and KIM-1 with renal injury index， blood glucose and lipid level. Methods A total of 89 patients with type 2 diabetes mellitus （T2DM） hospitalized in the Department of Endocrinology of Pingxiang People′s Hospital from January to July in 2019 were selected， and the patients were divided into normal albuminuria group or only diabetes group （group NA）， microalbuminuria group （group MI） and macro albuminuria group （group MA） according to the 24 h urinary protein excretion rate （UAER）. In addition， 53 healthy patients in the Physical Examination Department of Pingxiang People′s Hospital were selected as the normal control group （NC）. Serum concentrations of 4-HNE， YKL-40 and KIM-1 were determined by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Results The serum 4-HNE， YKL-40 and KIM-1 in the group MA were higher than those in the group MI， with statistically significant differences （P<0.05）. The serum 4-HNE， YKL-40 and KIM-1 in the group MI were higher than those in the group NA， with statistically significant difference （P<0.05）. The serum 4-HNE， YKL-40 and KIM-1 in the groups NA， MI and MA were higher than those in the group NC， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The fasting blood glucose （FPG）， glycosylated hemoglobin （HbA1c）， serum creatinine （SCr）， blood urea nitrogen （BUN）， UAER indexes in groups NA， MI MA were higher than those in group NC， with statistically significant differences （P<0.05）. Correlation analysis showed that SCR， BUN， Urinary microprotein （UmALB）， UAER， FPG and HbA1c were positively correlated with 4-HNE， YKL-40 and KIM-1 （r=0.428， 0.349， 0.390; 0.501， 0.446， 0.491; 0.478， 0.409， 0.461; 0.414， 0.502， 0.497; 0.584， 0.558， 0.607; P<0.05）. BUN was positively correlated with 4-HNE and YKL-40 （r=0.223， 0.176; P<0.05）. Low density lipoprotein （LDL） was negatively correlated with 4-HNE， YKL-40 and KIM-1 （r=-0.169， -0.289， -0.247; P<0.05）. Conclusion 4-HNE， YKL-40 and KIM-1 can be used as a sensitive indicator for the early diagnosis of DN， and is expected to provide a basis for the diagnosis of DN in clinical practice. Serum 4-HNE， YKL-40 and KIM-1 are positively correlated with renal injury index and blood glucose level.

[Key words] Diabetic nephropathy; Urinary albumin; Lipid peroxidation; Oxidative stress; Biomarker

糖尿病腎病（DN）是糖尿病（DM）的慢性并發癥之一，據統計，DM患者40%以上可出現腎損害，DN的治療已成為一個日益嚴重的挑戰，通過積極干預控制血糖刻不容緩[1]。Wang等[2]的研究顯示，血液動力學異常、高血糖誘導的代謝紊亂和炎癥因子之間相互作用構成了DN的病理生理學基礎，故推測DN發病及進展與血糖長期升高及活性氧（ROS）有關。臨床調查發現[3]，DN存在相對較長的無臨床表現期，繼而在無DN相關臨床表現的情況下通過尿液檢測出尿微量蛋白（UmALB），最終導致終末期腎病（ESRD）。盡管目前臨床上大多以檢測UmALB作為DN的早期診斷方法，但UmALB并不敏感，并且在伴有組織損傷和炎癥的DM患者尿液檢測可出現UmALB。腎穿刺是DN診斷的金標準，但其為一種侵入性檢查方法，因此臨床應用受限[4]。故需尋找新的診斷指標檢測早期DN，減少ESRD發生。

相關研究表明，DM大鼠隨腎臟損傷逐漸加重，血清4-羥基壬烯醛（4-HNE）表達水平逐漸升高，并提示脂質過氧化參與DN進展[5];Han等[6]研究認為血清人軟骨糖蛋白-39（YKL-40）參與了DN腎臟損傷的過程，且與尿蛋白排泄率（UAER）成正相關;而血清腎損傷分子-1（KIM-1）能較快反映DN早期腎臟損傷[7]。目前，研究血清4-HNE、YKL-40、KIM-1表達水平在早期DN診斷中的臨床意義的相關研究較少。本研究主要觀察血清4-HNE、YKL-40、KIM-1對評價DN腎臟早期病理損害的臨床意義，并分析血清4-HNE、YKL-40、KIM-1與腎損傷檢測指標、血糖水平、血脂水平的相關性，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2019年1～7月萍鄉市人民醫院內分泌科收治的89例2型糖尿病（T2DM）患者，其中男43例，女46例;年齡28～77歲，平均（57.0±8.8）歲。患者均通過連續兩次24 h尿蛋白定量檢查，結果以兩次平均值計算24 h UAER，根據24 h UAER結果將患者分為正常蛋白尿組/單純糖尿病組（NA組，UAER<20 μg/min）、微量蛋白尿組（MI組，UAER 20～<200 μg/min）和大量蛋白尿組（MA組，UAER≥200 μg/min）。NA組30例，男11例，女19例;年齡55.50（50.0，61.25）歲。MI組35例，男17例，女18例;年齡56（50.00，66.00）歲;MA組24例，男15例，女9例;年齡60（52.25，66.00）歲。

另選萍鄉市人民醫院體檢科的53例健康體檢者作為健康對照組（NC組），其中男27例，女26例;年齡27～70歲，平均（55.0±9.8）歲。

各組的性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究已經萍鄉市人民醫院醫學倫理委員會審核批準。

1.2納入及排除標準

納入標準：①DM患者均為參照1999年世界衛生組織糖尿病專家委員會制定的診斷標準確定的T2DM患者，且病程<15年;②血壓≤140/90 mmHg，三酰甘油（TG）≤5.0 mmol/L，糖化血紅蛋白（HbA1c）≤12%者。

排除標準：①存在其他因素所致的肝、腎臟疾病，嚴重的心腦血管疾病、1型糖尿病、腫瘤、妊娠、合并炎癥及晨起劇烈運動的患者;②吸煙者;③近期有糖尿病酮癥酸中毒、高滲性昏迷者。

1.3方法

1.3.1試劑與儀器? ①4-HNE、YKL-40、KIM-1檢測試劑盒購于上海極威生物科技有限公司，均按照試劑盒說明操作;②全自動蛋白分析儀（貝克曼庫爾特型號IMMAGE800）;③全自動生化分析儀（貝克曼庫爾特 LX20）;④全自動糖化分析儀（成都柯尼特科技有限公司型號Premier Hb9210）;⑤酶標儀、洗板機（雷杜生命科學股份有限公司型號RT-6100、RT-3100）。

1.3.2樣本采集? 研究對象均空腹12 h采集靜脈血3 ml，3000 r/min離心10 min;收集血清凍存于-80℃冰箱。

1.3.3相關指標濃度測定? ①采用ELISA法檢測各組血清標本中的4-HNE、YKL-40、KIM-1濃度;②采用免疫比濁法檢測UmALB;③HbA1c：高效液相色譜法;④UAER：雙縮脲法;⑤空腹血糖（FPG）：葡萄糖氧化酶法;⑥血清肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、TG采用酶法測定。

1.4觀察指標

①觀察四組的腎損傷指標，主要包括BUN、SCr、24 h UAER及UmALB;②比較四組的血糖及血脂指標水平，血糖指標主要包括FPG及HbA1c，血脂指標包括LDL、HDL、TG;③比較四組的血清4-HNE、YKL-40、KIM-1表達水平。

1.5統計學方法

采用SPSS 24.0統計學軟件對數據進行分析，定性資料以頻數表示，組間比較采用χ2檢驗;符合正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），差異有統計學意義再行SNK法多重比較;不符合正態分布的以中位數M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H非參數檢驗，差異有統計學意義再行Nemenyi法多重比較;相關性采用Pearson相關系數表示，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1四組腎功能指標的比較

MI、MA組患者BUN高于NA、NC組，差異有統計學意義（P<0.05）;MI組與MA組患者BUN比較，差異無統計學意義（P>0.05）;NA組與NC組BUN比較，差異無統計學意義（P>0.05）;MI、MA組患者SCr、UAER及UmALB高于NA、NC組，MA組患者SCr、UAER及UmALB高于MI組，差異有統計學意義（P<0.05）;NA組與NC組SCr、UAER、UmALB比較，差異無統計學意義（P>0.05）（表1）。

2.2四組血糖及血脂指標水平的比較

NA、MI、MA組的FPG、HbA1c高于NC組，差異有統計學意義（P<0.05）;NA、MI、MA組的FPG、HbA1c比較，差異無統計學意義（P>0.05）;MA組的LDL低于NC組，差異有統計學意義（P<0.05）;四組的HDL、TG比較，差異均無統計學意義（P>0.05）（表2）。

2.3四組血清4-HNE、YKL-40、KIM-1水平的比較

NA、MI、MA組患者的血清4-HNE、YKL-40、KIM-1水平高于NC組，MI、MA組患者的血清4-HNE、YKL-40、KIM-1水平高于NA組，MA組患者的血清4-HNE、YKL-40、KIM-1水平高于MI組，差異均有統計學意義（P<0.05）（表3，圖1）。

2.4臨床生化指標與4-HNE、YKL-40、KIM-1的相關性分析

SCr、UmALB、UAER、FPG、HbA1c與4-HNE、YKL-40、KIM-1成正相關（r=0.428、0.349、0.390，0.501、0.446、0.491，0.478、0.409、0.461，0.414、0.502、0.497，0.584、0.558、0.607;P<0.05）;BUN與4-HNE、YKL-40成正相關（r=0.223、0.176，P<0.05）;LDL與4-HNE、YKL-40、KIM-1成負相關（r=-0.169、-0.289、-0.247，P<0.05）（表4）。

3討論

高糖狀態可使細胞氧化應激、脂質過氧化水平升高，而脂質過氧化的亞穩態醛可作為第二信使，刺激多種細胞產生炎癥甚至細胞凋亡，提升氧化應激水平[8]，致ROS過表達，刺激細胞膜上磷脂雙層的多不飽和脂肪酸結構上的氫以誘發脂質過氧化，使4-HNE過表達，影響細胞信號轉導，從而導致細胞凋亡和腎臟病理損傷[9-10]。Chen等[11]研究顯示，當4-HNE處于低濃度時可能發揮抗氧化作用，降低氧化應激對腎臟造成的損傷。此外，高糖狀態時，血清4-HNE與腎臟損傷程度成正相關[12]，故DN早期通過檢測4-HNE可避免發生腎臟不可逆損傷。

YKL-40由單核細胞向巨噬細胞分化產生，活化的巨噬細胞具有分泌YKL-40的功能，當血脂水平升高合并斑塊血管時，巨噬細胞和血管平滑肌細胞（VSMCs）中存在YKL-40表達[13]。VSMCs通過外源性信號誘導遷移至細胞內膜，而YKL-40通過刺激VSMCs遷移和重組，以調節血管內皮細胞的形態[14]，促進分支小管的形成。此外，Rathcke等[13，15]的研究顯示，YKL-40表達水平與內皮功能障礙程度成正相關，參與早期內皮功能損傷，并與DN腎損傷程度成正相關，提示YKL-40具有早期發現DN腎臟損傷的作用。

KIM-1是一類跨膜糖蛋白，具有膜結構域和胞質結構域，包含兩個同源基因KIM-1a和KIM-1b[16]，且同源基因具有不同的細胞質結構域。Lim等[17]研究認為高糖、肥胖等代謝因素可導致腎臟局部氧化應激、ROS形成增加，使血清KIM-1表達升高，提示其與局部腎損傷機制相關。Sabbisetti等[18]研究對DN患者進行觀察，發現血清KIM-1表達水平與腎小球濾過率估值下降率密切相關，并發現KIM-1在腎缺血早期存在表達，且與腎臟病理損傷程度成正相關，故推測KIM-1早期可間接反應腎臟病理損傷。

本研究結果顯示，NA、MI、MA組患者的血清4-HNE、YKL-40、KIM-1水平高于NC組，MI、MA組患者的血清4-HNE、YKL-40、KIM-1水平高于NA組，MA組患者的血清4-HNE、YKL-40、KIM-1水平高于MI組，差異均有統計學意義（P<0.05）;血清4-HNE、YKL-40、KIM-1在NC組表達水平極低，NA組UmALB、SCr等腎臟損傷指標維持正常范圍時，血清4-HNE、YKL-40、KIM-1已開始表達，且隨著DN患者蛋白尿逐漸增多，患者血清4-HNE、YKL-40、KIM-1的表達進一步升高，提示血清4-HNE、YKL-40、KIM-1的表達水平與DM腎臟損害程度有關，對DN的早期腎臟病變起到預測作用。

本研究結果顯示，FPG、HbA1c與4-HNE、YKL-40、KIM-1成正相關（r=0.414、0.502、0.497，0.584、0.558、0.607;P<0.05），提示長期維持血糖穩定可顯著降低4-HNE、YKL-40、KIM-1的表達，減輕DN患者腎臟損傷的程度。此外，NA、MI、MA組的FPG、HbA1c高于NC組，差異有統計學意義（P<0.05）;NA、MI、MA組的FPG、HbA1c比較，差異無統計學意義（P>0.05），考慮可能因DM患者晚期接受胰島素降糖治療的依從性相對較高所致。SCr、UmALB、UAER與4-HNE、YKL-40、KIM-1成正相關（r=0.428、0.349、0.390，0.501、0.446、0.491，0.478、0.409、0.461;P<0.05）;BUN與4-HNE、YKL-40成正相關（r=0.223、0.176，P<0.05），提示4-HNE、YKL-40、KIM-1與腎臟損傷程度成正相關，但NA組與NC組的SCr、UAER、UmALB比較，差異無統計學意義（P>0.05），NA組與NC組的BUN比較，差異無統計學意義（P>0.05），推測SCr、BUN、UmALB在DN早期并不能準確判斷患者的腎臟病變程度。4-HNE、YKL-40、KIM-1與LDL成負相關（r=-0.169、-0.289、-0.247，P<0.05），與HDL、TG無相關性（P>0.05）;MA組的LDL低于NC組，差異有統計學意義（P<0.05），并且四組的HDL、TG比較，差異均無統計學意義（P>0.05），提示血脂水平不能間接反應腎損傷程度，考慮與臨床降脂藥物治療影響血脂水平有關。

目前，UmALB是臨床診斷早期腎臟損害的無創診斷方法，但并不敏感，易受到運動、感染、高血壓等因素干擾，而24 h UAER檢測在門診工作中的依從性甚差，故血清4-HNE、YKL-40、KIM-1可作為診斷早期DN的敏感、可重復性、無創的檢測指標，具有一定的臨床價值。

[參考文獻]

[1]Figueroa-Pérez，Marely G，Pérez-Ramírez，et al.Diabetic nephropathy is ameliorated with peppermint （Mentha piperita） infusions prepared from salicylic acid-elicited plants[J].J Funct Foods，2018，43：55-61.

[2]Wang M，Wang S，Yao D，et al.A novel long non-coding RNA CYP4B1-PS1-001 regulates proliferation and fibrosis in diabetic nephropathy[J].Mol Cell Endocrinol，2016，426：136-145.

[3]Bjornstad P，Cherney D，Maahs DM.Early diabetic nephropathy in type 1 diabetes-new insights[J].Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes，2014，21（4）：279-286.

[4]Wang J，Wang G，Liang Y，et al.Expression profiling and clinical significance of plasma microRNAs in diabetic nephropathy[J].Diabetes Res，2019，2019：5 204 394.

[5]劉桂美，季文萱，黃俊彥，等.4羥基壬烯醛在糖尿病大鼠腎臟中的表達及意義[J].中國中西醫結合腎病雜志，2013， 14（9）：773-775.

[6]Han JY，Ma XY，Yu LJ，et al.Correlation between serum YKL-40 levels and albuminuria in type 2 diabetes[J].Genet Mol Res，2015，14（4）：18 596-18 603.

[7]黃炎，章爽，黃偉，等.腎損傷分子-1在糖尿病腎臟早期損傷中的診斷價值研究[J].中國實驗診斷學，2017，21（8）：1299-1302.

[8]Ramana KV，Srivastava SK，Ansari NH，et al.4-Hydroxynonenal in the pathogenesis and progression of human diseases[J].Curr Med Chem，2014，21（2）：230-237.

[9]Liu G，Ji W，Huang J，et al.4-HNE expression in diabetic rat kidneys and the protective effects of probucol[J].J Endocrinol Invest，2016，39（8）：865-873.

[10]Fritz KS，Galligan JJ，Smathers RL，et al.4-Hydroxynonenal inhibits SIRT3 via thiol-specific modification[J].Chem Res Toxicol，2011，24（5）：651-662.

[11]Chen ZH ，Niki E.4-Hydroxynonenal （4-HNE） has been widely accepted as an inducer of oxidative stress.Is this the whole truth about it or can 4-HNE also exert protective effects？[J].IUBMB Life，2010，58（5-6）：372-373.

[12]席悅.西格列汀對糖尿病腎損傷的保護作用研究[D].北京：中國人民解放軍醫學院，2014.

[13]Rathcke CN，Vestergaard H.YKL-40，a new inflammatory marker with relation to insulin resistance and with a role in endothelial dysfunction and atherosclerosis[J].Inflamm Res，2006，55（6）：221-227.

[14]Malinda KM，Ponce L，Kleinman HK，et al.Gp38k，a protein synthesized by vascular smooth muscle cells，stimulates directional migration of human umbilical vein endothelial cells[J].Exp Cell Res，1999，250（1）：168-173.

[15]Mahdy RA，Nada WM，Hadhoud KM，et al.The role of vascular endothelial growth factor in the progression of diabetic vascular complications[J].Eye（London，England），2010，24（10）：1576-1584.

[16]Ismail OZ，Zhang X，Bonventre JV，et al.G protein α12（Gα12） is a negative regulator of kidney injury molecule-1-mediated efferocytosis[J].AJP Renal Physiology，2015， 310（7）：607–620.

[17]Lim AI，Tang SCW，Lai KN，et al.Kidney injury molecule-1：more than just an injury marker of tubular epithelial cells？[J].J Cell Physiol，2013，228（5）：917-924.

[18]Sabbisetti VS，Waikar SS，Antoine DJ，et al.Blood kidney injury molecule-1 is a biomarker of acute and chronic kidney injury and predicts progression to ESRD in type Ⅰ diabetes[J].J Am Soc Nephrol，2014，25（10）：2177-2186.

（收稿日期：2019-10-11? 本文編輯：閆? 佩）