葡萄中酵母菌的篩選及菌株鑒定

馮炘

摘要：以葡萄為菌源，分別在葡萄發(fā)酵的前期、中期、后期取一定的發(fā)酵液進(jìn)行稀釋涂布，后經(jīng)過YPD培養(yǎng)基對涂布后的菌株進(jìn)行分離純化。將分離純化后的菌株進(jìn)行WL培養(yǎng)基聚類分析及生理生化實(shí)驗(yàn)，并用TTC培養(yǎng)基對菌株進(jìn)行初篩，選取紅色最深的菌株作為復(fù)篩菌株。對復(fù)篩菌株進(jìn)行發(fā)酵性能測定篩出發(fā)酵性能較好菌株，編號為Y1，并對此菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。Y1菌株的26S r DNA鑒定結(jié)果表明其為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），此菌株為后續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)。

Abstract： With grape as the source of bacteria， a certain fermentation broth was diluted and coated in the early， middle， and late stages of grape fermentation， and the coated strain was separated and purified by YPD medium. The isolated and purified strains were subjected to WL culture cluster analysis and physiological and biochemical experiments， and the strains were pre-screened with TTC medium. The reddest strain was selected as the re-screening strain. The fermentation performance of the double-screened strain was determined， and the strain with better fermentation performance was screened out， and the number was Y1， and molecular biology identification was performed on the strain. The 26S r DNA identification of Y1 strain showed that it was Saccharomyces cerevisiae， which provided a basis for subsequent fermentation experiments.

關(guān)鍵詞：酵母菌;分離鑒定;發(fā)酵特性;生理生化

0? 引言

酵母菌是一類被廣泛應(yīng)用在發(fā)酵工業(yè)中的單細(xì)胞真菌，它廣泛分布在自然界各處[1]。酵母菌是以芽孢繁殖為主的單細(xì)胞真核微生物，大部分的酵母菌是腐生的，生活在含糖量較高、偏酸性的環(huán)境中，如生長在花朵、植物果實(shí)表面等，還有很大一部分生活在蔬菜園、水果園園的土壤中;小部分為寄生的[2，3]。酵母菌的生長繁殖速度較快、也比較容易分離純化。酵母常用于釀酒、食品制作等，是人類最早應(yīng)用于生活的微生物之一。隨著人們對酵母菌研究的逐步深入，酵母菌也逐漸被應(yīng)用在酶制劑、物料生產(chǎn)、醫(yī)藥工業(yè)以及環(huán)境保護(hù)等各個(gè)方面。

目前，酵母菌主要應(yīng)用在構(gòu)建基因工程菌、釀酒及其他發(fā)酵產(chǎn)業(yè)。釀酒酵母可以發(fā)酵不同來源的植物碳水化合物，例如：水果汁等。葡萄果實(shí)甜度高、顆粒飽滿、營養(yǎng)豐富，適合微生物的生長繁殖，酵母菌在有氧和無氧的環(huán)境中都能生長，即酵母菌是兼性厭氧菌，在有氧的情況下，它把糖分解成二氧化碳和水且酵母菌生長較快;在缺氧條件下，細(xì)胞進(jìn)行無氧酵解，在酶的作用下，葡萄糖代謝為丙酮酸，丙酮酸在無氧條件下，在細(xì)胞內(nèi)丙酮酸脫羧酶和乙醛脫氫酶作用下，生成乙醇和二氧化碳[4-6]。

微生物菌株是生產(chǎn)乙醇的主力軍，在以木質(zhì)纖維素為原材料的發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的工藝中，酵母菌的篩選顯得格外重要[7-10]。本文以葡萄為菌源，通過稀釋涂布、YPD分離純化、WL培養(yǎng)基聚類分析、生理生化、TTC培養(yǎng)基初篩及菌株發(fā)酵性能測定得到發(fā)酵性能較高的菌株，為之后課題組對秸稈發(fā)酵液產(chǎn)乙醇的工藝提供了基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與試劑

1.1.1 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸粉10g，瓊脂粉25g，蒸餾水1000mL，pH自然，115℃滅菌20min。

TTC培養(yǎng)基：上層：葡萄糖5g，2，3，5-三苯基氯化四氮唑0.5g，瓊脂15g、蒸餾水1000mL;下層：YPD瓊脂培養(yǎng)基，121℃滅菌 20min。

WL培養(yǎng)基：葡萄糖50g，蛋白胨5g，酵母浸粉5g，氯化鉀0.425g，磷酸二氫鉀0.55g，氯化鈣0.125g，氯化鐵0.0025g，硫酸錳0.0025g，硫酸鎂0.125g，溴甲酚綠0.022g，瓊脂粉20g，蒸餾水1000ml，pH 5.5，121℃滅菌20min。

活化培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸粉10g，蒸餾水1000mL，pH自然，115℃滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40g，蛋白胨20g，酵母浸粉10g，蒸餾水1000mL，pH5.0，115℃滅菌20min。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

葡萄糖，蛋白胨，酵母浸粉，瓊脂粉，2，3，5-三苯基氯化四氮唑，溴甲酚綠，KH2PO4，KCL，CaCL2，MgSO4，F(xiàn)eCL3，MnSO4，NaNO3，NaCL，CaCO3等均為分析純。

1.1.3 菌株來源

本研究的菌株分離自葡萄自然發(fā)酵的前期、中期和后期。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分離與純化

稱50g新鮮成熟度好的葡萄，搗碎，放入50mL已滅菌的蒸餾水中，30℃靜置培養(yǎng)。分別于發(fā)酵的初、中、后期取一定濃度的發(fā)酵汁0.1mL，梯度稀釋至10-7倍均勻涂布于YPD瓊脂培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)48h。隨機(jī)挑取15-20個(gè)單菌落，以劃線方式在YPD平板上分離純化。此過程重復(fù)3-5次。菌株于4℃冰箱保存。

1.2.2 菌株的WL聚類分析

將分離菌株劃線接種于WL培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)及顏色，可對照《酵母菌的特征及鑒定手冊》對菌株進(jìn)行初步分類鑒定[11]。

1.2.3 菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)《酵母菌的特征與鑒定手冊》可知，酵母菌的生理生化實(shí)驗(yàn)主要包括：氮源同化、碳源同化以及糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn) [12]。

1.2.4 TTC篩選法

將保藏的酵母菌株用YPD液體培養(yǎng)基活化后，一一對應(yīng)涂布于 TTC 底層培養(yǎng)基上，在28 ℃恒溫箱中培養(yǎng) 48 h。待滅菌后的上層培養(yǎng)基已冷卻為 45～50℃時(shí)倒在底層培養(yǎng)基上，于 30℃無光條件下培養(yǎng)2-4h 后，取出立即觀色，根據(jù)菌落呈色情況挑選菌種。

1.2.5 酵母菌發(fā)酵性能測定

酵母菌在無氧條件下通過呼吸作用，將糖類轉(zhuǎn)化為乙醇，并放出二氧化碳，以上過程可表示為C6H12O6→2C2H5OH+2CO2。由此式可知，通過CO2產(chǎn)生的量可以對菌種的發(fā)酵能力進(jìn)行推斷，繼而表征發(fā)酵效率[13]。

配制100mL YPD發(fā)酵培養(yǎng)基，按 10%的接種量接入種子液，同時(shí)將未接種的發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照，稱重后放入培養(yǎng)條件為28℃、120r/min的搖床培養(yǎng)箱中，發(fā)酵過程中每隔12h 取出稱重，直至發(fā)酵液前后質(zhì)量差與對照組質(zhì)量差相當(dāng)，即認(rèn)為發(fā)酵終止。計(jì)算排氣前后重量差，即 CO2釋放量。

1.2.6 菌株的分子生物學(xué)鑒定

將菌種送寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行26s rDNA區(qū)擴(kuò)增及序列測定[14-16]。根據(jù)測序結(jié)果，通過NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫中BLAST進(jìn)行相關(guān)序列搜索進(jìn)行同源序列搜索，比較測序菌株與已知酵母菌相應(yīng)序列的相似程度 [17]。

2? 結(jié)果與分析

2.1 分離純化結(jié)果

通過數(shù)代的分離純化，共獲得能在YPD培養(yǎng)基上良好生長的菌株9株將其統(tǒng)一編號為C1-C9，酵母菌形態(tài)描述見表1。

2.2 鏡檢結(jié)果

將菌株一一對應(yīng)制作成水玻片，再將制好的裝片放在顯微鏡下進(jìn)行觀察，由低倍鏡到高倍鏡， 鏡檢結(jié)果描述見表2。

由表2可知：初篩得到的菌株細(xì)胞形態(tài)大多為橢圓形或圓形，另外還有少數(shù)呈檸檬形，皆為多端出芽的無性繁殖，無假菌絲出現(xiàn)且有子囊孢子。

2.3 WL培養(yǎng)基聚類

生長于WL培養(yǎng)基上的酵母菌的菌落形態(tài)和顏色會因?yàn)榉N類不同而出現(xiàn)較明顯的區(qū)別[18]。WL培養(yǎng)基菌落形態(tài)見表3。

依據(jù)表3的菌落顏色及形態(tài)與《酵母菌：特征與鑒定》第三版中的菌株特征對照，初步鑒定出C1為中間型酒香酵，C2為葡萄汁有孢漢遜酵母，C3、C6、C8為釀酒酵母菌，C4為戴爾有孢圓酵母[19，20]。剩余菌株暫無鑒定結(jié)果。

2.4 生理生化分析

由表4可知，9株菌都可以利用葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵，幾乎不能利用阿拉伯糖和木糖進(jìn)行發(fā)酵。至于其它幾種糖，分別呈陽性、弱陽性、陰性。

由表5可知，9株菌株均可在以葡萄糖、蔗糖和半乳糖為碳源的液體培養(yǎng)基中生長，呈陽性;至于乳糖、阿拉伯糖、木糖則呈陽性、弱陽性、陰性等。

由表6可看出，這9株不同菌株都可以在以蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨或尿素的培養(yǎng)基上生長，且生長狀況良好，呈陽性。

2.5 TTC篩選結(jié)果

TTC平板顯色結(jié)果如圖1所示。

比較圖1中的顯色結(jié)果可知，C2、C5、C7培養(yǎng)基中菌落呈現(xiàn)深紅色，其余的則偏粉紅色和淺白色。將顯色反應(yīng)更為明顯即顯色后顏色更為深紅的菌株劃線分離后并將其分別重新編號得到Y(jié)1、Y2、Y3，篩得的3株菌株即為發(fā)酵產(chǎn)乙醇能力較強(qiáng)的菌株。

2.6 CO2釋放量測定

由圖2可知，3株酵母菌的CO2釋放量均隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而逐漸減少，即在發(fā)酵過程的前24h時(shí)，發(fā)酵效率最大，隨后產(chǎn)生的 CO2含量減少，即單位時(shí)間發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇含量減少。因此前24h的CO2釋放量作為發(fā)酵效率高低的比較指標(biāo)。圖中Y1在24h時(shí)的CO2釋放量明顯高于其它兩株菌，初步推斷Y1菌株的發(fā)酵效率高于其它兩株。

2.7 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

使用MEGA-X 軟件進(jìn)行多序列對位排列，并采用N-J方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分離菌株Y1與標(biāo)準(zhǔn)菌株Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-12632的同源性超過99%，表明其具有較近的親緣性。菌株Y1鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

3? 結(jié)論

通過YPD培養(yǎng)基分離純化出9株酵母菌，分別編號為C1-C9。對9株酵母菌進(jìn)行碳源同化、氮源同化和糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，9株酵母菌都可以利用葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵，幾乎不能利用阿拉伯糖和木糖進(jìn)行發(fā)酵，且均可在以葡萄糖、蔗糖和半乳糖為碳源的液體培養(yǎng)基和以蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨或尿素的培養(yǎng)基上生長，生長狀況良好，呈陽性。

通過WL培養(yǎng)基聚類分析初步判斷C3、C6、C8為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、C4為戴爾有孢圓酵母（Torulaspora debrueckii）、C2為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum），其它菌株暫無分類結(jié)果。通過TTC培養(yǎng)基篩選出3株乙醇高產(chǎn)菌株，重新命名為Y1、Y2、Y3。通過CO2釋放量測定表明Y1的發(fā)酵性能最。通過對Y1菌株的分子生物學(xué)鑒定表明，分離菌株Y1與標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性超過99%，表明其具有較近的親緣性，菌株Y1鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊清香，王哲.酵母菌在自然界中的生態(tài)分布及功能[J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2009（4）：92-97.

[2]崔小亮，邵小兵，鐘和平，等. 多糧濃香型白酒生產(chǎn)過程中可培養(yǎng)酵母菌多樣性分析與優(yōu)質(zhì)功能菌篩選[J].中國釀造，2019， 38（7）：105-110.

[3]李海濤，劉艷環(huán)，苗利光，等.東北山葡萄釀酒酵母的分離與鑒定[J].特產(chǎn)研究，2019（3）：27-30.

[4]Heinz K. Renewable resources： Build a biomass energy market[J]. Nature. 2013， 494（7435）：29.

[5]Zhao W，Zhao F，Zhang S， et al. Ethanol production by simultaneous saccharification and cofermentation of pretreated corn stalk[J]. Journal of basic microbiology. 2019， 59（7）：744-753.

[6]陳燕，王小芬，金偉，等.產(chǎn)纖維素酶霉菌的篩選及初步鑒定[J].武漢輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，30（3）：6-8.

[7]Talebnia F，Mighani M，Rahimnejad M， et al. Ethanol production from steam exploded rapeseed straw and the process simulation using artificial neural networks[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 2015， 20（1）：139-147.

[8]Xia J，Yang Y，Liu CG， et al. Engineering Zymomonas mobilis for Robust Cellulosic Ethanol Production[J]. Trends in biotechnology. 2019， 37（9）：960-972.

[9]Huang D，Wang M，Guan G， et al. Ethanol production from corn stover using mixed cultures of Zymomonas mobilis and Candida shehatae[J]. Food and Fermentation Industries. 2017， 43（1）：31-36.

[10]Zhao C，Zou Z，Li J， et al. A novel and efficient bioprocess from steam exploded corn stover to ethanol in the context of on-site cellulase production[J]. Energy. 2017， 123：499-510.

[11]劉愛國.寧夏賀蘭山東麓葡萄釀酒酵母菌的分離及其分類鑒定[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)，2008.

[12]陶森，王雅玲，葉林，等.腌魚中耐鹽酵母菌的分離鑒定及其生理生化特性[J].食品工業(yè)科技，2019，40（02）：136-141，147.

[13]張本旭，于紅霞，李夏云，等.海葵基底附生酵母的分離鑒定與乙醇發(fā)酵效率研究[J].釀酒科技，2019（8）：33-39.

[14]曹亞璞，王豪杰，白斌錦，等.拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)大棚果蔬酵母菌的分離與鑒定[J].保鮮與加工，2019，019（001）：140-146.

[15]LiuXZ，WangQM，GokerM. Towards an integrated phylogenetic classification of the Tremellomycetes[J]. Studies in Mycology. 2015， 81：85-147.

[16]Nisiotou AA，Spiropoulos AE，Nychas G-JE. Yeast Community Structures and Dynamics in Healthy and Botrytis-Affected Grape Must Fermentations[J]. Applied & Environmental Microbiology. 2007， 73（21）：6705-6713.

[17]Hesham AEL，Alrumman SA，Al-Dayel MA， et al. Screening and genetic identification of acidic and neutral protease-producing yeasts strains by 26S rRNA gene sequencing[J]. Cytology & Genetics. 2017， 51（3）：221-229.

[18]周春艷，張秀玲，王冠蕾.酵母菌的5種鑒定方法[J].中國釀造，2006（08）：55-58.

[19]Pallmann CL，Brown JA，Olineka TL， et al. Use of WL Medium to Profile Native Flora Fermentations[J]. 2016， 52（3）：198-203.

[20]楊瑩，徐艷文，薛軍俠，等.WL營養(yǎng)瓊脂對葡萄酒相關(guān)酵母的鑒定效果驗(yàn)證[J].微生物學(xué)雜志，2007（5）：81-84.