UHPLC-MS/MS法測定大鼠血漿中硼替佐米的含量

劉進(jìn) 柳珂 蔣巍 黃翠云 鄧易 束暢 張鳳

[摘要] 目的 建立超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測硼替佐米的方法，并用于大鼠血漿硼替佐米濃度的測定。方法 采用蛋白沉淀法處理血漿樣品，色譜柱為Waters XBridge BEH C18 柱（2.5 μm，2.1 mm×50 mm），以乙腈-醋酸銨（10 mmol/L）為流動(dòng)相梯度洗脫，流速為0.3 mL/min，柱溫為35°C，多反應(yīng)檢測正離子模式分析。 結(jié)果 硼替佐米血漿濃度在0.5～100 ng/mL線性范圍內(nèi)良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y = 14.41X-0.4490（r = 0.9974）。定量下限為0.5 ng/mL，低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性結(jié)果均良好。 結(jié)論 該法準(zhǔn)確、靈敏、重現(xiàn)性好，可用于大鼠硼替佐米藥效動(dòng)力學(xué)研究。

[關(guān)鍵詞] 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法;硼替佐米;血漿;藥效動(dòng)力學(xué)

[中圖分類號] R971.1 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）04（a）-0022-04

Determination of Bortezomib in rat plasma by UHPLC-MS/MS method

LIU Jin1 ? LIU Ke2 ? JIANG Wei3 ? HUANG Cuiyun3 ? DENG Yi3 ? SHU Chang3 ? ZHANG Feng3

1.Department of Hematology， Shanghai Changzheng Hospital， Shanghai ? 200003， China; 2.Department of Oncology， Shanghai Changzheng Hospital， Shanghai ? 200003， China; 3.Department of Pharmacy， Shanghai Changzheng Hospital， Shanghai ? 200003， China

[Abstract] Objective To establish an ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of Bortezomib in rat plasma. Methods Plasma sample preparation was treated by protein precipitation. ColumWaters XBridge？誖 BEH C18 （2.5 μm， 50 mm × 2.1 mm） was used as the column. Acetonitrile and 10 mmol/L ammonium formate solution was used as the mobile phase， with gradient elute， the volume flow rate was 0.3 mL/min， the column temperature was maintained at at 35℃. Multi-reaction detection positive ion mode was used to analysis. Results The Bortezomib in the range of 0.5-100 ng/mL showed a good liner， the standard linear regression equation was Y = 14.41X-0.4490 （r = 0.9974）. The lower limit of quantification was 0.5 ng/mL， and the results of in-day， day-time precision and accuracy， extraction recovery， matrix effect and stability of quality control samples with low， medium and high 3 mass concentrations were all good. Conclusion The method is accurate， sensitive and reproducible， and can be used in the pharmacokinetic study of Bortezomib in rats.

[Key words] Ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometer/mass spectrometer; Bortezomib; Plasma; Pharmacokinetic

化療是多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）主要治療手段[1-3]。作為新型可逆蛋白酶體抑制劑，硼替佐米（Bortezomib，BTZ）顯著提升了MM患者的無進(jìn)展生存期與總體生存期[4]，通常聯(lián)合用藥[5-9]以增強(qiáng)效果。由于BTZ最常見的不良反應(yīng)周圍神經(jīng)病變與其累積劑量密切相關(guān)[10-12]，其體內(nèi)血藥濃度暴露量會受到聯(lián)合用藥的影響[13-15]，而基于動(dòng)物模型考察其藥物相互作用是評價(jià)其臨床安全用藥的有力工具。因此，有必要建立大鼠血漿中BTZ含量測定方法，為后期其藥物相互作用研究提供技術(shù)支撐。超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（UHPLC-MS/MS）由于其耗時(shí)少、高分辨率、高靈敏度的特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于復(fù)雜化合物體系的測定分析[16-19]。因此，本研究基于快速、準(zhǔn)確、靈敏的UHPLC-MS/MS開展血漿中BTZ的濃度檢測，并運(yùn)用于大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究。

1 材料

1.1 儀器與試藥

Agilent 1260 UHPLC串聯(lián)6460 QQQ質(zhì)譜系統(tǒng)（安捷倫公司，美國）;CPA2250十萬分之一電子分析天平（賽多利斯，德國）;漩渦混合器（萊伯特公司，美國）;低溫離心冷凍濃縮儀（LaboGene公司，丹麥）;5810R離心機(jī)（艾本德公司，德國）;Milli-Q超純水儀（美國）。藥品BTZ（商品名萬珂，批號170620344，西安楊森制藥有限公司）;BTZ和內(nèi)標(biāo)（IS）氟康唑（FLC）購買于大連美侖生物醫(yī)藥有限公司（中國，純度>98%）;乙腈、甲醇購自默克公司（色譜純級，德國）;甲酸購自天地公司（分析純級，美國）。注射用肝素鈉，6250 U/mL;羧甲基纖維素鈉;灌胃針;注射器;眼眶靜脈采血毛細(xì)管。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥動(dòng)學(xué)研究

SD雄性大鼠6只（180～220 g），購自斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號：SCXK（滬）2007-0005]，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。BTZ尾靜脈注射（0.15 mg/kg）后，進(jìn)行如下12個(gè)時(shí)間點(diǎn)的眼眶后靜脈叢取血：5、15、30 min，1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱為Waters XBridge BEH C18柱（2.5 μm，2.1 mm×50 mm），柱溫維持在35°C;進(jìn)樣體積5 μL;流動(dòng)相為乙腈（A相）和10 mmol/L醋酸銨溶液（B相），流速為0.3 mL/min，梯度洗脫程序?yàn)?-0.5-1.5-1.6-2.5-3.0 min，A相20%-60%-60%-95%-95%-20%。質(zhì)譜條件見表1。

表1 ? 質(zhì)譜檢測參數(shù)和化合物MRM檢測參數(shù)

注：ESI：電噴霧電離源;MRM：多反應(yīng)檢測掃描;BTZ：硼替佐米;FLC：氟康唑;IS：內(nèi)標(biāo)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品的配制

配置1.00 mg/mL BTZ、FLC儲備液，于-80°C保存。以10%甲醇水溶液稀釋BTZ儲備液，得濃度為5、10、20、50、100、500、1000 ng/mL的工作溶液;以含0.1%甲酸的乙腈進(jìn)行稀釋，配制成含10 ng/mL FLC的蛋白沉淀劑。精密吸取BTZ工作溶液100 μL，分別加入空白血漿900 μL，依次配制成含BTZ濃度分別為0.5、1、2、5、10、50、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，渦旋混勻后備用。同理配置濃度為1、5、50 ng/mL的質(zhì)控樣本。

2.3 血漿樣品制備

于1.5 mL含肝素鈉5 μL的塑料離心管中，加入空白血漿100 μL和200 μL含10 ng/mL IS的乙腈，進(jìn)行蛋白沉淀，渦旋混勻30 s后，12 000 r/min離心10 min（離心半徑9.5 cm），取上清5 μL進(jìn)樣。

2.4數(shù)據(jù)分析

采用Agilent Masshunter B.06.00工作站（安捷倫公司，美國）、Drug and Statistics 2.0 version 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（DAS 2.0，中國藥理學(xué)會）對液質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和分析。

2.5 方法專屬性

在測試的6份空白血樣中未見有與標(biāo)準(zhǔn)添加樣品中各個(gè)待測化合物相同碎片離子及相同出峰位置的干擾雜質(zhì);在大鼠服藥后的血樣與標(biāo)準(zhǔn)添加樣品中BTZ的離子碎片及出峰位置相對應(yīng)，本法專屬性良好。見圖1。

2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線

按“2.2”項(xiàng)下操作制備標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)質(zhì)控樣本，進(jìn)行UHPLC-MS/MS分析。以BTZ的血藥濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積AS與內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行權(quán)重回歸（權(quán)重系數(shù)為w=1/C2）。根據(jù)Mass Hunter軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y = 14.41X-0.4490（r = 0.9974），其在0.5～100.0 ng/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限（LLOQ）為0.5 ng/mL。

2.7 精密度與準(zhǔn)確度

將LLOQ及3個(gè)不同濃度質(zhì)控樣品進(jìn)行檢測，每個(gè)濃度平行配制5份樣品，計(jì)算得樣品批內(nèi)和批間精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.46%～5.11%，準(zhǔn)確度相對誤差（RE）為-8.36%～9.67%。見表2。

2.8 基質(zhì)效應(yīng)與回收率

取6份不同來源的空白大鼠血漿按照“2.3”項(xiàng)下制備血漿樣品后，加入低、中、高BTZ溶液及內(nèi)標(biāo)溶液得提取后添加溶液，測得BTZ峰面積A1;類似地，用10%甲醇水溶液配置低、中、高的水標(biāo)樣品，同法測得BTZ峰面積A2，根據(jù)公式A1/A2×100%計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。空白血漿加入適量的BTZ工作溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，配置成低、中、高的提取后添加樣品，按照“2.3”項(xiàng)下制備血漿樣品后，同法測得峰面積A3，計(jì)算提取回收率（A3/A1×100%）。結(jié)果顯示樣本提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)均在可接受范圍，見表3。

2.9 樣品穩(wěn)定性

采用低中高濃度質(zhì)控樣品，考察凍融循環(huán)穩(wěn)定性、長期穩(wěn)定性、樣本處理后穩(wěn)定性。低中高濃度質(zhì)控樣品各種不同類型的穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示，相對誤差在可接受范圍內(nèi)（-10.82%～8.22%）、在上述條件下，樣本均未發(fā)生明顯的降解、變質(zhì)現(xiàn)象。見表4。

2.10 稀釋效應(yīng)

將血樣以大鼠空白血漿稀釋10、50倍后的實(shí)測濃度與理論濃度比較，其準(zhǔn)確度分別為3.44%、6.87%;RSD分別為3.94%、3.40%（n = 3）。

2.11 藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果

以血藥濃度對給藥時(shí)間作圖得BTZ在大鼠體內(nèi)消除的平均血藥濃度-時(shí)間曲線圖。見圖2。計(jì)算得藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)：AUC0～t（72.32±16.46）（h·ng/mL），AUC0～∞（163.90±77.58）（h·ng/mL），MRT0～∞（39.96±11.39） h，t1/2（0.14±0.048）h，Cmax（22.69±8.36）ng/mL。

3討論

3.1 UHPLC-MS/MS方法學(xué)改進(jìn)

課題組前期建立了MM常用化療方案中包括BTZ在內(nèi)的6種藥物人血漿濃度的檢測方法，采用固相萃取法進(jìn)行前處理，且每個(gè)樣本液質(zhì)分析時(shí)間為10 min[20]。本研究只對BTZ開展分析，因此為了縮短分析時(shí)間、降低檢測成本，根據(jù)待測物性質(zhì)將方法調(diào)整為較為簡便廉價(jià)的蛋白沉淀法。其次，考察了Agilent ZORBAX SB C18柱（3.5 μm，2.1 mm×100 mm）、Agilent poroshell SB C18柱（2.7 μm，2.1 mm×75 mm）以及Waters XBridge？誖 BEH C18柱（2.5 μm，2.1 mm×50 mm）色譜柱對分析的影響，結(jié)果化合物在Waters XBridge？誖BEH C18柱上峰形、響應(yīng)和重現(xiàn)性較好。

3.2 UHPLC-MS/MS方法學(xué)應(yīng)用

將建立的分析方法成功用于BTZ經(jīng)靜脈注射后在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究。結(jié)果顯示，BTZ進(jìn)入血液循環(huán)后迅速分布并代謝，生物半衰期較短（約1.5 h），可推斷其進(jìn)入體內(nèi)快速代謝而發(fā)揮抗腫瘤功效。

3.3 總結(jié)

本研究基于UHPLC-MS/MS對大鼠血漿中BTZ開展快速檢測，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果符合生物樣本分析要求，成功用于BTZ在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究。

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（收稿日期：2019-07-30 ?本文編輯：劉永巧）