致病性大腸桿菌對犢牛腸黏膜功能的影響

崔銀雪 ，敖日格樂 ＊，王純潔 ，斯木吉德 ，阿日查 ，何利娜 ，張 劍 ，劉 波 ，張 晨

（1.內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.內蒙古農業大學獸醫學院，內蒙古 呼和浩特010018）

誘發犢牛腹瀉的因素較多，細菌性腹瀉占主導地位[1]。犢牛細菌性腹瀉主要是由致病性大腸桿菌引起的犢牛急性、接觸性及傳染性疾病的臨床表現。如犢牛敗血病常發生于10日齡以內的初生犢牛，初期表現為腹瀉，漸漸地體重下降、采食量降低、眼球凹陷和嚴重脫水，最終衰竭死亡[2]。腸黏膜是動物腸道防御體系的重要組成部分，炎癥是腸黏膜傷口的重要表現。腸黏膜受到損傷時，黏膜中包含上皮細胞和免疫細胞在內的多種細胞捕捉炎癥細胞產生的信號，進一步傳播和放大炎癥，同時先天性免疫細胞產生的信號被觸發并調整適應性免疫系統，從而導致抗原特異性反應[3]。犢牛早期腸道發育尚不完善，免疫、吸收和分泌等功能與腸道功能關聯密切，但是其功能容易因外來致病菌定植而破壞，導致腸道發生炎癥反應，繼而機體健康受到損傷。因此，本研究以致病性E.coli O1為研究對象，揭示其對犢牛腸黏膜功能的作用機理。

1 材料

1.1 試驗動物

2019年9月在內蒙古自治區鄂爾多斯市騎士牧場，選擇體況良好、體重相近的48頭初生公犢牛為試驗動物。

1.2 菌株與試劑耗材

致病性E.coli O1，內蒙古農業大學動物科學學院牛生產實驗室保存；營養瓊脂培養基和營養肉湯培養基，購自廣東環凱微生物科技有限公司；牛源ELISA試劑盒，購自江蘇酶免實業有限公司。

1.3 試驗儀器

凈化工作臺購自蘇州博萊爾凈化設備有限公司，生化培養箱購自上海智城分析儀器制造有限公司，全功能酶標儀購自美國伯騰儀器有限公司，高速冷凍離心機購自德國Sigma公司，微量移液器購自Eppendorf。

2 方法

2.1 試驗動物分組與給藥

將實驗室保存的致病性E.coli O1接種到固體營養瓊脂培養基中，37℃培養24 h，挑單個菌落于營養肉湯中搖床37℃培養24 h，制成懸浮液。將48頭初生犢牛隨機分為對照組和試驗組，每組各24頭。試驗開始時，試驗組犢牛口服混有致病性E.coli O1（2.5×1011CFU/mL，100 mL）的牛奶后正常飼喂，對照組犢牛常規哺乳，持續觀察10 d。

2.2 樣品采集

犢牛口服后 12 h、36 h、48 h、72 h 和 10 d，采集犢牛回腸組織放入5 mL凍存管中，置于液氮中帶回實驗室-80℃保存。

2.3 腸黏膜相關指標測定

取凍存于-80℃冰箱的回腸組織0.1 g放入經過高壓滅菌處理的研缽中，用少量液氮將其迅速凍結并研磨成粉末狀，隨后加入0.9 mL經過121℃滅菌的無菌生理鹽水充分混勻，制成10%的組織勻漿液。用超聲波細胞粉碎機進行超聲處理后，3 000 r/min離心15 min，吸取上清液檢測腸三葉因子（ITF）、分泌型免疫球蛋白(SIgA)、緊密連接蛋白Occludin、緊密連接蛋白Claudin-1、緊密連接蛋白ZO-1和細胞因子（IL-4、IL-6、IL-10）的含量，檢測步驟依照試劑盒說明書進行。

2.4 數據統計與分析

數據用Excel 2016做簡單處理，通過SPSS 24.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA，)顯著性檢驗，測定結果以“平均值±標準誤”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05為差異不顯著。

3 結果與分析

3.1 致病性E.coli 01對犢牛腸黏膜細胞通透性的影響

致病性E.coli O1對犢牛腸黏膜細胞通透性的影響見表1。由表1可知，試驗組Claudin-1濃度在12 h、24 h、36 h 和 48 h 顯著低于對照組 （P＜0.05），對照組Occludin和ZO-1濃度在同一時間顯著高于試驗組（P＜0.05）。

表1 致病性E.coli 01對犢牛腸黏膜細胞通透性的影響

3.2 致病性E.coli 01對犢牛回腸組織細胞因子的影響

致病性E.coli 01對犢牛回腸組織細胞因子的影響見表2。由表2可知，試驗組血清中TGF-β在不同時間段與正常組相比差異均顯著（P＜0.05），具有統計學意義；IL-10和IL-4隨著時間變化有逐漸升高趨勢，但是在各時間段均顯著低于對照組（P＜0.05）。

表2 致病性E.coli 01對犢牛回腸組織中IL-4、IL-6和IL-10的影響

3.3 致病性E.coli 01對犢牛腸道SIgA和ITF的影響

致病性E.coli 01對犢牛腸道SIgA和ITF的影響見表3。由表3可知，試驗組SIgA濃度在第5天前逐漸降低，隨后升高再降低，在同一時間顯著低于對照組 （P＜0.05）；ITF濃度在試驗組中隨著時間變化有逐漸降低趨勢，而且低于對照組，同一時間與對照組相比差異極顯著（P＜0.05）。

表3 致病性E.coli 01對犢牛腸道SIgA和ITF的影響

4 討論

4.1 致病性E.coli 01對犢牛腸黏膜細胞通透性的影響

腸黏膜功能不僅能夠抵擋外來入侵者進入腸黏膜上皮細胞，還可以促進腸蠕動，當機體受到損傷發生感染時能夠導致腸黏膜損傷[4]。緊密連接蛋白是腸黏膜功能極為重要的一部分，能夠加強屏障功能，是其結構基礎。閉鎖蛋白Occludin、Claudin家族與ZO-1和ZO-2等都是緊密連接的重要成員，盡管它們的分子量范圍較寬，但是它們在結構上具有相似性，包括2個同型與鄰近細胞上的完整膜蛋白相互作用的細胞外環。Occludin是第一個定位于緊密連接原纖維的完整膜蛋白，通過調節細胞通透性發揮重要作用。當其發生異變或者減少時，會增加腸上皮細胞的通透性，導致大分子物質進入其中，腸道受到損傷破壞時可用其作為主要檢測指標[5]。試驗組Occludin和Claudin-1與對照組相比顯著降低，Occludin作為重要的腸道上皮細胞間緊密連接蛋白，與Claudins蛋白在動物腸道細胞膜上大量存在，共同構成選擇性屏障，起到增加細胞間的通透性、粘附和移動的作用。ZO-1蛋白不僅參與細胞的物質轉運過程，還可以通過C-末端結構域與肌動蛋白F-action直接相互作用，通過N-末端PDZ結構域與其他ZO蛋白和Claudins直接相互作用，促進細胞骨架和TJ復合體之間的分子聯系，致病性大腸桿菌能夠通過破壞上皮細胞緊密連接蛋白的穩定性而導致緊密連接破壞，與TJs相關的Claudin-1水平降低，對腸道細胞通透性具有一定的影響。本試驗中試驗組Occludin、Claudin-1和ZO-1水平顯著低于對照組，表明致病性E.coli 01能夠增加犢牛腸黏膜細胞通透性，破壞犢牛腸道黏膜功能。

4.2 致病性E.coli 01對犢牛回腸組織細胞因子的影響

IL-4是由CD4+T細胞亞群、指定的TH2細胞和嗜堿性細胞產生的能夠活化T細胞、B細胞和胸腺細胞的多效性生長因子，也由一種特殊的T細胞亞群所產生。研究表明，IL-4能夠抑制單核細胞產生IL-1、TNF-a和IL-6。IL-6是具有調節免疫系統和機體代謝的多種活性細胞因子，直接參與局部或全身急性炎癥反應，也參與組織炎癥浸潤等其他炎癥方面的調節，是急性反應的誘導因子。IL-10是在控制腸道抗原刺激反應中起著關鍵作用的免疫調節性細胞因子，能夠終止炎癥反應和恢復T細胞對腸道細菌的耐受性。炎癥細胞因子在組織中擴散后共同作用，以誘導上皮損傷，激活局部巨噬細胞，成纖維細胞和內皮細胞也被相繼激活產生介質，從而促進整體免疫反應和持續性炎癥。本試驗發現試驗組IL-4和IL-10水平顯著低于對照組，IL-6水平顯著高于對照組，表明犢牛感染致病性E.coli 01能夠促進促炎因子，抑制抗炎因子的產生，進而促發炎癥反應。

4.3 致病性E.coli 01對犢牛腸道SIgA和ITF的影響

黏膜中的SIgA是一種針對外在性病原體和抗原的一線防御中的黏膜表面分子，既可以非特異性免疫消除具有免疫排斥的病原體，又可以在病原體引起的特異性免疫中發揮作用，是具有獨特結構和功能特征的一級抗體[6]。本試驗中試驗組SIgA水平顯著降低，說明致病性E.coli 01能夠降低腸黏膜免疫防御功能。ITF在哺乳動物的多種組織中廣泛存在，主要存在于動物小腸和大腸的黏膜細胞中，由腸道黏膜杯狀細胞合成并分泌，是杯狀細胞分泌到小腸和大腸腔中的蛋白酶抗性因子，能夠促進細胞增殖和重建區域上皮細胞，對細胞有保護作用[7]。ITF能夠增強淺表細胞的抵抗力，降低上皮細胞的通透性，在腸黏膜損傷中加強細胞與細胞的連接[8]，促進細胞的遷移和抑制細胞凋亡來實現促進上皮細胞修復和生長，與黏蛋白作用形成黏液膠層，進而增強腸黏膜功能的作用[9]。此外有研究表明，ITF在腸道中抑制腸道促炎因子的分泌使炎癥反應減輕。當多種腸道損傷顯著增加時，ITF可以防止腸上皮損傷和促進修復。本研究中試驗組ITF濃度顯著低于對照組，說明致病性E.coli O1能夠顯著降低ITF水平，降低其對細胞的修復作用，與黏蛋白的結合降低，進而對腸黏膜功能的作用降低，使其在腸道發生炎癥反應時修復功能減弱。

5 結論

綜上所述，致病性E.coli 01能夠增加犢牛腸黏膜細胞的通透性，降低SIgA的合成，抑制ITF對細胞的修復，促進炎癥反應，進而損傷腸黏膜功能。