生豬屠宰場非洲豬瘟檢測能力比對

（山西省動物疫病預防控制中心，山西 太原 030027）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種急性、烈性、高度致死性動物傳染病，發病率及死亡率均較高[1]，嚴重危害養豬業的健康發展，我國將其列為一類疫病。自2018年8月我國報告首起非洲豬瘟疫情以來，非洲豬瘟給我國養豬業造成了巨大的經濟損失[2]。由于當前缺乏疫苗和有效藥物，故強化監測檢測、加強生物安全管理等控制措施尤為重要[3]。目前，非洲豬瘟病毒的檢測方法主要有PCR、熒光PCR及環介導等溫擴增等分子生物學方法，常用的是PCR和熒光PCR方法[4]。

為了進一步做好山西省非洲豬瘟的防控工作，降低生豬屠宰環節及產品流通環節病毒擴散的風險，根據山西省農業農村廳《關于開展生豬屠宰環節非洲豬瘟檢測能力比對工作的通知》等文件要求，山西省動物疫病預防控制中心于2019年9月組織開展了非洲豬瘟檢測能力比對工作，以期了解山西省生豬屠宰環節非洲豬瘟的檢測能力，并為下一步非洲豬瘟的防控工作提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 比對項目

根據山西省生豬屠宰環節非洲豬瘟檢測能力比對工作方案要求，檢測比對項目為非洲豬瘟病毒核酸檢測。

1.2 比對方法

本次比對工作采取熒光PCR方法。

1.3 比對樣品及評判標準

比對樣品共設有5份盲樣，山西省動物疫病預防控制中心獸醫實驗室使用國家ASF參考實驗室提供的引物探針及陽性對照進行檢測，標定參考值后進行分裝、唯一性編號和分發。為考察不同廠家生產的試劑盒對標定盲樣的敏感性及特異性，本次比對試驗未分發統一的核酸檢測試劑，由各參與企業自備。因不同廠家生產的便攜式熒光定量PCR儀的檢測結果判定規則不同，故未規定檢測結果Ct值的具體范圍，比對樣品參考值及評判標準見表1。

表1 比對樣品參考值及評判標準

2 檢測比對結果

2.1 比對結果

全省共有11個市82個縣區的96家生豬定點屠宰企業報名參加本次非洲豬瘟病毒核酸檢測能力比對，共發放比對盲樣96套，計480份。71家企業比對結果符合，比對符合率為74.0%。比對樣品結果符合的共有438份，符合率為91.2%。具體結果見表2、表3。

在比對結果出現錯誤的25家企業中，比對樣品檢測結果錯誤的數量為1～4個；出現假陰性結果的有19家，出現假陽性結果的有4家，既存在假陰性又存在假陽性的有2家。假陰性率為84.0%（21/25），假陽性率為 24.0%（6/25）。

本次比對結果的Kappa=82.2%，顯示檢測值與參考值符合率較高，具有較好的一致性。具體結果見表2、表 3。

表2 非洲豬瘟病毒核酸檢測比對樣品結果

表3 檢測值和參考值符合情況

2.2 儀器設備情況

本次比對工作要求各企業提供所用儀器設備型號。經統計，除1家屠宰企業使用實時熒光定量PCR儀外，其余95家屠宰企業均使用便攜式熒光定量PCR儀，涉及18家生產廠家的31種設備型號。

2.3 檢測試劑盒情況

本次比對工作未提供統一的檢測試劑盒，根據匯總結果得知，有94家屠宰企業使用經農業農村部批準或經中國動物疫病預防控制中心比對符合要求的檢測試劑盒，涉及11個生產廠家；有1家企業使用未經批準或比對符合要求的試劑盒，還有1家企業未提供相關試劑盒信息。

3 討論

3.1 屠宰企業非洲豬瘟自檢和檢測能力比對的意義

檢測能力比對，是有效評價相關檢測實驗室的技術能力、操作水平和管理水平的重要手段，也是有效的質量控制手段[5]。屠宰環節是連接產業鏈的重點環節，企業實施非洲豬瘟屠宰自檢工作，能以最小人力、最低經濟成本達到最大限度控制，切斷病毒的傳播途徑。將屠宰企業納入檢測能力比對范圍，可為主管部門監管和客觀評價屠宰企業的檢疫能力提供技術支撐，可及時發現該環節存在的問題，不僅能夠及時開展追溯和消除隱患工作，還能夠嚴防染疫生豬產品進入食品加工流通環節，保證生豬健康生長[6]，因此具有重要的現實意義。本次比對結果顯示，全省96家參加比對的屠宰企業，僅有71家企業比對結果符合要求，比對符合率為74.0%。比對結果的符合率偏低，說明仍有較大的提升空間。

3.2 屠宰企業非洲豬瘟自檢符合率偏低的可能原因

從本次比對試驗結果可以看出，有25家企業的檢測結果有不同程度的錯誤，假陰性率為84.0%（21/25），暴露出了生豬屠宰環節屠宰場自檢過程中多個環節均存在一定的問題。這可能與檢測試劑盒的敏感性、檢測設備的穩定性及人員的操作手法有一定的關系。可能原因，一是檢測人員能力亟需提升。部分屠宰企業實驗室檢測人員對于熒光定量PCR試驗的檢測方法不夠熟悉，對基本概念理解不清，對檢測結果不會判斷或者判斷錯誤，不會通過樣品的原始擴增曲線判斷檢測結果，僅僅依賴于儀器自動出具的結果。相關人員缺乏實驗操作技能等專業知識的培訓，僅經過儀器廠家組織的裝機操作培訓，無法滿足檢測的實際需求[7]。二是檢測試劑和儀器設備不統一。經過統計，本次參加比對的96家企業，使用的檢測試劑和檢測儀器設備種類繁多、來源復雜，價格也存在較大的差異，缺少統一的標準。對于屠宰企業而言，價格不能成為唯一的考量因素和標準，更不能為達到某種目的選擇敏感度不高的試劑。對于檢測儀器設備，需要定期進行比對校準，以確保檢測結果的穩定性。三是部分企業軟硬件方面存在一定的問題。比對結果不符合的企業在管理水平、參試人員素質及儀器設備使用方面與比對結果符合的企業存在一定的差距。部分比對不符合的企業未對檢測場地進行分區管理，所有操作均在同一區域進行，極易造成污染。還有部分企業未對參試人員進行上崗前有針對性的培訓，僅在購買儀器時由廠家的技術人員進行培訓后匆匆上崗，上崗后未持續跟蹤驗證其檢測能力。更有部分企業人員不能根據曲線圖進行結果判定，完全依靠儀器自動讀取結果并進行判定，不會根據實際檢測結果的基線噪音情況進行調整。

3.3 對檢測方法的細節需多加注意

3.3.1 熒光定量PCR是一項具有較強專業性的工作，在檢測工作中需要注意的細節較多，對任何細節的忽視，都會導致檢測結果的錯誤，進而出具錯誤的檢測報告。進行PCR試驗時，不同的步驟應在不同的區域完成，如果將所有的操作置于同一區域進行，極易造成氣溶膠的污染，進而出現假陽性、假陰性的結果。進行移液操作時，必須要注意移液槍的穩定性及完好性，防止出現由于移液槍不穩定或損壞而導致沒有吸取到足夠液體或完全沒有吸取到液體，進而得出錯誤的結果。進行試驗時，不能為降低檢測成本而不設陰性對照和陽性對照。未設立陰陽對照，無法說明檢測結果是否成立。對于任何試驗均需設立陰陽對照，判斷試驗是否成立，如此才可以進一步用于檢測結果的判定。

3.3.2 注重生物安全。在假陰性結果廣泛存在的情況下，病毒擴散的風險極高。屠宰企 業一定要高度重視生物安全，加大生物安全方面的投入，提高檢測人員的生物安全意識，嚴防病毒的擴散。

3.4 提升屠宰企業非洲豬瘟的自檢能力

針對本次比對過程中出現的問題，各地畜牧獸醫主管部門要強化培訓指導和監督檢查工作，要開展專項培訓，進一步增強檢測人員的業務能力，確保檢測結果真實準確。要加大監管力度，落實企業主體責任，建議由市級畜牧獸醫主管部門定期對轄區屠宰企業的實驗室開展留樣抽檢復核工作，對復核結果不準確的屠宰場應該暫停生產，造成疫病擴散的還應該追究相應的法律責任。

4 結論

通過本次比對試驗發現，山西省生豬屠宰環節非洲豬瘟病毒的核酸比對符合率為74.0%，比對樣品結果符合率為91.25%，Kappa值為82.2%，顯示一致性較高，表明山西省生豬屠宰環節非洲豬瘟的自檢結果較好，但是仍有26.0%的企業比對結果不符合，需要進一步加強屠宰場自檢能力的監督管理。對于比對不合格的企業，應當及時組織再一次進行比對工作，確保將病毒擴散的風險降至最低。

本次比對試驗由于各屠宰場自備檢測試劑盒進行檢測，沒有統一發放，對于檢測儀器設備及檢測人員具體操作能力的評判仍然存在不足，在今后的工作中將嘗試統一發放比對盲樣及比對檢測試劑盒，以便更加準確地對操作人員的能力進行評判。