低溫條件下人工濕地氨氧化微生物的群落結構特征

蔡張杰 崔麗娟 李晶 李偉 雷茵茹

摘要：為了解冬季低溫條件下人工濕地沉積物的氨氧化潛力及其影響因素，以北京市漢石橋濕地自然保護區內的人工濕地為研究對象，測定了不同濕地單元沉積物的硝化潛勢（PNR）及其相關功能基因的豐度。結果表明，沉積物的PNR較高，說明冬季人工濕地具有較高的硝化潛力。PNR從入水段到出水段呈現先增加后減少的趨勢。通過建立硝化活性與功能微生物豐度的線性回歸模型發現，氨氧化古菌（AOA，以AOA的 amoA基因豐度表征）是影響硝化潛勢的主要功能微生物。進一步構建硝化微生物豐度與環境因子的回歸方程，發現影響AOA ?amoA基因豐度的主要環境因子是碳氮比（C/N），影響氨氧化細菌（AOB，以AOB的 amoA基因豐度表征）豐度的主要環境因子是全氮（TN）含量。高通量測序測定人工濕地沉積物AOA和AOB的群落組成，各濕地單元檢測到的AOB群落優勢門為Proteobacteria，主要是β-Proteobacteria綱，AOA主要屬于Crenarchaeota和Thaumarchaeota 2個門類。濕地4單元和5單元，1單元和6單元在AOB菌群群落組成上較為接近;濕地6單元、7單元、8單元在AOA菌群群落組成上較為接近。

關鍵詞：人工濕地;硝化潛勢;功能基因豐度;群落結構;環境因子

中圖分類號：X171.1文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）02-0373-11

Abstract：To understand the potential nitrification rate of the constructed wetland sediments under low temperature conditions in winter and its influencing factors， the constructed wetland in the Hanshiqiao Wetland Nature Reserve in Beijing was selected as the research area， and the potential nitrification rate （PNR） and the abundance of their related functional genes were investigated. The results showed that the PNR of the sediment was higher， indicating that the constructed wetland had higher nitrification potential in winter. The PNR increased first and then decreased from the inlet section to the outlet section. By establishing a linear regression model of nitrification activity and functional microbial abundance， we found that ammonia-oxidizing archaea （AOA， characterized by the abundance of amoA gene in AOA） was the main functional microorganism affecting the nitrification potential. By further constructing the regression equation of microbial abundance and environmental factors， it was found that the main environmental factor affecting the abundance of AOA amoA gene was carbon-nitrogen ratio （C/N）， and the main environmental factor affecting the abundance of ammonia-oxidizing bacteria （AOB， characterized by abundance of amoA gene in AOB） was total nitrogen （TN） content. High-throughput sequencing was used to determine the community composition of AOA and AOB in constructed wetland sediments. The dominant phylum of AOB community in each wetland unit was Proteobacteria， which was mainly composed of β-subdivision of Proteobacteria， and AOA mainly belonged to Crenarchaeota and Thaumarchaeota. In terms of community composition， for AOB， wetland units 4 and 5， 1 and 6 were relatively similar in flora composition， for AOA， wetland units 6， 7， 8 were relatively close.

Key words：constructed wetland;potential nitrification rate;functional genes′ abundance;community structure;environmental factor

人工濕地能夠有效處理氮素污染，其主要的除氮機制為植物和微生物的作用[1-2]。微生物以其主導的硝化-反硝化作用等過程可去除60%～90%的氮[3-5]。氨氧化作用是硝化作用的限速步驟，是氮循環的中心環節。在中國北方，冬季低溫條件下，植物衰老死亡后其吸收的氮素分解回歸濕地環境，微生物代謝緩慢，有機質在基質中積累[6]，導致人工濕地生態系統在冬季低溫時運行效率較低[7-8]，進而影響人工濕地的推廣普及。近年來，國內外學者開展了對人工濕地冬季低溫條件下運行狀況的研究。這些研究多用水體氮形態變化表征除氮效果，較少涉及沉積物的硝化作用，也較少從功能微生物的角度評價除氮效果。

本研究以北京市漢石橋濕地自然保護區的人工濕地為對象，采集冬季冰封期不同處理單元的沉積物，測定其硝化潛勢，并測定氨氧化功能基因（amoA）的豐度以及環境因子，揭示冬季低溫條件下人工濕地的硝化潛勢及其生物和非生物影響因子，以期為提高濕地冬季運行效率提供理論參考。此外本研究采用Miseq高通量測序的方法分析不同處理單元的反硝化細菌群落，利用冗余分析方法探究其與環境因子的關系，以期為人工濕地氨氧化細菌、氨氧化古菌群落結構的空間分布以及細菌環境影響因子的研究提供依據，為人工濕地微生物除氮機制研究提供理論依據。

1材料與方法

1.1研究區概況及樣品采集

北京市漢石橋人工濕地建于2015年，共有8個處理單元（圖1）。1單元的水源是游船區的湖水，2單元的水源是附近餐廳和廁所的污水。人工濕地總面積約為3 400 m2，種植的植物為香蒲、菖蒲、水蔥、蘆葦等。各單元底部均鋪有砂石或礫石防滲，單元之間通過下方管道實現水流的連通。濕地內的水經多級處理，達到Ⅱ類水的標準后，通過地下管道從8單元排入附近河道。人工濕地在每年3月中旬蓄水，11月底入冬后排干。于2018年3月1日濕地無水期，在人工濕地8個處理單元各采集0～20 cm深的3個沉積物樣品，共24個樣品。

1.2沉積物理化性質和活性指標的測定

按照文獻[9]的方法，測定沉積物的pH值以及有機質（OM）、全碳（TC）、全氮（TN）、銨態氮（NH+4-N）、硝態氮（NO-3-N）含量。用電位法（土水比1.0∶2.5，質量比）測定pH值，用Cytation 5多功能酶標儀（BioteK，USA）測定有機質含量，用Vario Ⅱ元素分析儀（Elementar，German）測定TC和TN含量，用SmartChem200全自動間斷化學分析儀（WestCo，USA）測定NH+4-N和NO-3-N含量。硝化潛勢（PNR）的測定（以NO-2-N計）采用氯酸鹽抑制法[10]。

1.3DNA的提取和PCR擴增

利用Power Soil土壤DNA提取試劑盒（German，QIAGEN）提取基因組DNA。氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細菌（AOB）的amoA基因定量PCR分析均在Light Cycler 480Ⅱ（Roche，Switzerland）上進行。PCR反應體系為25.0 μl，包含12.5 μl TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa公司產品），正、反向引物各1.0 μl，DNA模板1.0 μl，其余用ddH2O（Takara，Japan）補足至25.0 μl。定量PCR所用引物及反應條件見表1。全部樣品使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司產品）切膠回收PCR產物，Tris_HCl洗脫，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將純化產物通過Illumina MiSeq平臺的標準測試方法進行高通量測序（由美吉桑格生物醫藥科技有限公司完成測序）。

1.4序列處理

應用Usearch軟件將所有優化序列Map至OUT代表序列，選出與OUT代表序列相似性在97%以上的序列，生成OUT表格。使用Qimme平臺與RDP Classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OUT代表序列進行分類學分析，對比SILVA數據庫，統計每個樣品的群落組成。若分類學數據庫中出現一些分類學譜系中的中間等級沒有科學名稱，以norank作為標記。分類學對比后根據置信度閾值進行篩選，如果某些分類譜系在某一分級別分值較低，在統計時以Unclassified標記。

1.5數據處理和分析

使用Microsoft Excel2013軟件（Microsoft，USA）進行試驗數據初步處理，使用SPSS22.0軟件（Chicago，IL，USA）進行統計分析，在OriginPro2018軟件（OriginLab，USA）上完成制圖。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）的Duncans法（P<0.05）檢驗多組樣本之間的差異性，采用成對數據t檢驗分析AOA與AOB amoA豐度的差異性。采用Spearman相關系數分析兩組變量之間的相關性，并用線性回歸進一步確定變量之間的關系。使用上海美吉生物醫藥科技有限公司的I-Sanger云平臺進行微生物的多樣性分析和分類學分析。

2結果與分析

2.1人工濕地沉積物主要理化性質與硝化活性

測定結果（表2）表明，人工濕地沉積物pH值介于7.97與8.34之間，呈弱堿性，在1單元和2單元之間pH值有顯著差異，其他單元之間均無顯著差異，1單元和6單元pH值最大，分別為8.25和8.34。OM、TC、TN含量從2單元至出水單元（8單元）均顯著降低（P<0.05）。C/N在1～5單元和6～8單元間存在顯著差異（P<0.05），其變化范圍為8.59～14.11。NH+4-N含量在1、4單元間存在顯著差異，其他單元之間不存在顯著差異，但存在一定的先增加后減少的趨勢。NO-3-N含量在4、5單元和其他單元之間存在顯著差異，該濕地各單元NH+4-N和NO-3-N含量均處于較高水平。

圖2顯示，3單元的硝化潛勢（PNR）最高[（0.30±0.02） μg/（g·h）]，6單元最低[（0.01±0） μg/（g·h）]。從3單元到8單元沉積物的PNR呈現顯著降低的趨勢（P<0.05）。

2.2人工濕地氨氧化微生物功能基因豐度

利用實時熒光定量PCR技術對各濕地單元沉積物樣品的氨氧化細菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）的amoA基因進行分析（圖3）。成對數據t檢驗結果表明，在所有濕地單元中，AOA amoA基因豐度均顯著高于AOB amoA基因豐度（t=6.678，P<0.01），二者的比值為1.44～31.35。在所有濕地單元中，AOA和AOB的amoA基因豐度分別為1 g 1.55×107～2.65×108拷貝、8.12×106～1.58×107拷貝。單因素方差分析結果表明，人工濕地3單元和4單元AOA amoA基因豐度與其他單元存在顯著差異（F=168.506，P<0.01）。人工濕地入水單元（1單元、2單元）AOB amoA基因豐度與其他單元存在顯著差異（F=9.471，P<0.01）。

分析PNR與相關功能基因的關系，結果表明PNR與沉積物中AOA amoA基因豐度呈極顯著正相關關系（相關系數為0.693**，P<0.01），AOA amoA基因豐度越高，PNR越大。說明該人工濕地在低溫條件下，AOA在硝化過程中作用較為重要。進一步分析氨氧化功能基因豐度與環境因子的關系，結果（表3）表明人工濕地冬季沉積物AOA amoA基因豐度與沉積物C/N呈極顯著負相關關系。AOB amoA基因豐度與OM、TC、TN含量呈極顯著正相關關系。

進一步對各功能基因與環境因子進行多元逐步回歸。結果（表4）表明，沉積物C/N比對人工濕地AOA amoA基因豐度影響最大，回歸方程決定系數R2為0.225;沉積物TN含量對AOB amoA基因豐度影響最大，回歸方程R2為0.332。

2.3人工濕地氨氧化微生物的α-多樣性

α-多樣性指標（OUT水平）可以在一定程度上表示樣點的群落特征。本研究中計算的α-多樣性指標有：豐富度指數（Chao1、ACE），表示一個群落中物種的復雜程度，值越高表明群落內物種的數目越多;優勢度指數（Simpson指數），表示一個群落中優勢菌群的地位和貢獻，值越高表明群落內物種數量差異越大，優勢菌群的主導地位越突出;多樣性指數（Shannon指數），是物種豐富度和均勻度的綜合指標，也是對Chao1指數和Simpson指數綜合的一個指數[12]。為了保證樣品的序列數一致，在計算各指標之前，對樣本OUT數目進行隨機抽平。計算結果（表5）顯示，氨氧化細菌Chao1指數最高的是3單元（58.00），最低的是5單元（31.00）; Simpson指數最高的為1單元（0.27），最低的為8單元（0.13）;Shannon指數最高的為8單元（2.47），最低的是1單元（1.58）。氨氧化古菌Chao1指數最高的是3單元（68.00），最低的是2單元（36.50）; Simpson指數最高的為5單元（0.34），最低的為8單元（0.10）;Shannon指數最高的為8單元（2.88），最低的是2單元（1.53）。

2.4人工濕地氨氧化微生物的β-多樣性

β-多樣性（OUT水平）可以用來比較各樣點間群落的差異，基于Bray-Curtis差異度指數計算樣點間的差異，進而對微生物群落排序，選取解釋度最大的兩軸做PCA圖（圖4）。對于AOB，兩軸對排序結果的解釋度分別為60.96%和19.57%。1單元和6單元，4單元和5單元的距離較近，說明這兩組的氨氧化細菌群落結構更相似。1單元和7單元距離最遠，說明這2個單元的氨氧化細菌群落結構差異較大。對于AOA，兩軸對排序結果的解釋度分別為61.95%和22.46%。1～5單元距離很近，說明這5個單元的氨氧化古菌群落結構更相似;6單元和7單元距離最遠，說明這2個單元的氨氧化古菌群落結構差異較大。這個結果與人工濕地沉積物氨氧化微生物的聚類結果（OUT水平）類似（圖5）。

2.5人工濕地氨氧化微生物的群落組成

對人工濕地沉積物樣品氨氧化細菌的所有序列進行聚類，共得到109個OTU，通過分類學統計得到門、屬2個水平的細菌群落結構組成。分別統計其門、屬類別的構成，形成柱狀圖（圖6），同時分析其在各個水平上的菌群結構。結果顯示檢測所得OUT主要屬于3個門類，分別是Proteobacteria（77.52%）、Unclassified_k_norank_d_Bacteria（21.68%）、Ammonia_oxidising_bacteria_ensemble（0.69%）。在屬水平上，所得OUT主要屬于9個屬，分別為Unclassified_o_Nitrosomonadales（30.28%）、Unclassified_k_norank_d_Bacteria（21.68%）、Nitrosospira（19.64%）、Norank_f_environmentl_samples（15.88%）、Norank_o_environmental_sample_c_Betaprotebacteria（0.05%）、Nitrosomonas（0.05%）、Environmental_samples_f_Nitrosomonadaceae（0.009%）、Nitrosovibrio（0.008%）、Norank_p_ammonia_oxidising_ensemble（0.007%）。

對沉積物樣品氨氧化古菌的測序序列進行聚類后，共得到74個OTU，通過分類學統計得到在門和屬上的群落結構組成（圖7）。檢測所得OUT主要屬于4個門類，分別是Unclassified_k_norank_d_Archaea（66.09%）、Crenarchaeota（24.02%）、Environmental_sample_k_norank_d_Archaea（7.48%）、Thaumarchaeota（2.32%）。在屬水平上，所得OUT主要屬于4個屬，分別是Unclassified_k_norank_d_Archaea（66.09%）、Norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeota（24.02%）、Norank_p_environmental_sample_k_norank（7.48%）、Nitrososphaera（2.26%）。

為比較不同單元氨氧化微生物群落組成的差異，應用Bray-Curtis距離算法和Complete聚類方法，將高豐度和低豐度的物種分塊聚類，通過顏色梯度及相似程度反應多個樣本在各分類水平上群落組成（屬水平）的相似性和差異性（圖8）。結果表明，氨氧化細菌群落相似度最高為86.6%，相似度較高，4單元與5單元，1單元與6單元菌群群落組成較為相近。氨氧化古菌群落相似度最高為87.2%，相似度較高，6單元、7單元、8單元與3單元、5單元、4單元、1單元、2單元群落組成相差較大，其中1單元與2單元，7單元與8單元菌群群落組成較為相似。

2.6人工濕地氨氧化微生物與沉積物理化性質的相關性

對沉積物理化環境因子與氨氧化微生物主要菌落（屬）所占比重進行中心標準化，并進行校正（蒙特卡洛置換檢驗），提取第一與第二坐標軸信息，進行冗余分析，發現對于氨氧化細菌，第一和第二坐標軸對方差總解釋率為83.10%。在所測樣品中，Nitrosomonas、Norank_o_environmental_samples_c_Bataproteobacteria、Norank_f_environmental_samples與沉積物中TC含量、TN含量、OM含量、C/N比呈正相關關系，與pH、NO-3-N含量呈負相關關系。而Environmental_samples-f_Nitrosomonadaceae、Unclassified_o_Nitrosomonadales與pH、NO-3-N含量呈正相關關系，與TC含量、TN含量、OM含量、C/N比呈負相關關系。對于氨氧化古菌，Nitrososphaera、Unclassified_k_norank_d_Bacteria、Norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeota與pH、C/N比呈正相關關系，與TC含量、TN含量、OM含量、NH+4-N含量、NO-3-N含量呈負相關關系。

進一步進行環境因子與物種的相關分析（圖9）。對于氨氧化細菌，pH值與Nitrosovibrio、Unclassified_o_Nitrosomonadales呈顯著正相關關系（r=0.810，P<0.05;r=0.714，P<0.05）與Norank_o_environmental_sample_c_Betaprotebacteria呈顯著負相關關系（r=-0.738，P<0.05），Environmental_samples_f_Nitrosomonadaceae與NO-3-N含量呈顯著負相關關系（r=-0.756，P<0.05）。對于氨氧化古菌，OM含量與Norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeota呈負相關關系（r=-0.785，P<0.05）。

3討論

本研究探討了低溫條件下人工濕地沉積物硝化潛勢，并應用高通量測序技術，針對氨氧化微生物的功能基因amoA進行擴增，較全面地考察了人工濕地冬季低溫時期沉積物中氨氧化微生物的群落組成，從α-多樣性、β多樣性、群落組成及其與環境因子的關系等方面進行分析。硝化潛勢是短期人為添加外源氮條件下的硝化強度，反映的是硝化作用的第一步——氨氧化作用的潛力，其產物NO-2是一些厭氧過程底物的重要來源，硝化作用是濕地環境有氧無氧界面的一個重要過程[10]。本研究中，冬季人工濕地沉積物PNR最大值為0.30 μg /（g·h），高于國內農田和森林生態系統PNR的平均水平，低于草地生態系統PNR[13]。

土壤微生物是土壤生化過程的驅動者，其生物量、群落結構、活性等特性都會直接影響到土壤硝化潛勢[5，14]。在本研究中，沉積物AOA amoA基因豐度顯著高于AOB amoA基因豐度。相關分析結果也表明，硝化潛勢和AOA amoA基因豐度呈現極顯著的正相關關系，AOA在本研究的人工濕地硝化作用中發揮著重要的作用，這與杭州灣濱海濕地沉積物及中國南方酸性土壤中AOA占主導優勢的結論相一致[15-16]。AOA和AOB有生態位分異的特征[16]。本研究中，人工濕地沉積物AOA amoA基因豐度與C/N比值呈極顯著負相關關系，AOB amoA基因豐度與OM、TC、TN含量均呈極顯著正相關關系，這與章芳等[17]的研究結果相似。多元回歸分析結果表明，C/N比值是影響AOA amoA豐度的主要環境因子，C/N比值影響有機質的礦化，C/N比值越低，有機質分解速率越快[17]。TN含量是影響AOB amoA的主要環境因子。

在計算氨氧化細菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）的α-多樣性時，由于各指數計算方法的不同，不同指標給出的結果略有差異。本研究中Chao1指數（豐富度指數）最高單元的Shannon指數（多樣性指數）并不是最高，同樣，Shannon指數最高單元的Chao1指數也并不是最高。例如3單元AOB的Chao1指數最高，但其Shannon指數僅為1.88，其最大值為2.47;3單元AOA的Chao1指數最高，但其Shannon指數僅為2.15，最高為2.88。8單元AOB的Shannon指數最高，但其Chao1指數為57.43，最高為58.00;8單元AOA的Shannon指數最高，但其Chao1指數為61.00，最高為68.00。出現這種現象的原因是，3單元中氨氧化微生物的群落組成最復雜，但群落內個體數目的分布不均勻，而8單元群落組成不是最復雜，但其群落組成分布均勻。而Simpson指數（優勢度指數）較高單元的Chao1指數（豐富度指數）往往較低，Simpson指數較低單元的Chao1指數往往較高。

氨氧化微生物在氮素循環中占有重要的地位，是土壤中較敏感的功能性微生物類群[18]。在群落組成上，氨氧化細菌的群落多樣性高于氨氧化古菌。本研究中，各濕地單元檢測到的氨氧化細菌群落優勢門為Proteobacteria，主要是由β-Proteobacteria（77.51%）組成。β-Proteobacteria作為優勢門的優勢綱，常見于淡水環境中[19]，海洋中較少發現。人工濕地中β-Proteobacteria絕大多數屬于Nitrosomonadales目Nitrosomonadaceae科。Nitrosomonadaceae科主要包含Nitrosospira和Nitrosomonas 2個屬[20]。Nitrosomonas在硝化作用第一階段起主導作用，可以促進NH+4氧化成NO-2;Nitrosospira是陸地生態系統中的優勢種，可作為硝化細菌，將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽[21]。本研究中人工濕地氨氧化細菌最多的屬為Unclassified_o_Nitrosomonadales，即在科水平上未分類的Nitrosomonadales目細菌。本研究中Nitrosospira豐度高于于Nitrosomonas，表明Nitrosospira在硝化作用中的數量優勢。Nitrosomonas青睞于低氨態氮環境，而Nitrosospira更適應高氨態氮的污染環境[22]。不同菌屬的分布不同，Nitrosomonas屬在7、8單元的豐度高于1～6單元，而Nitrosospira屬在7、8單元的豐度低于1～6單元。

氨氧化古菌在淡水濕地生態系統氮循環過程中占有重要地位，但人們對其在氨氧化過程中的貢獻的了解還不夠充分[23]。在陸地生態系統中，氨氧化古菌的數量遠遠高于氨氧化細菌的數量，但是氨氧化古菌是酸性土壤硝化作用的主導者[24]。泉古菌門（Crenarchaeota）和奇古菌門（Thaumarchaeota）是古菌的2種門類， Crenarchaeota是氨氧化古菌的主要類群[25]，但在洞庭湖岸邊沉積物中，發現的AOA主要是屬于Thaumarchaeota[26]。本研究的人工濕地中，AOA主要屬于Crenarchaeota和Thaumarchaeota 2個門類，且以Crenarchaeota豐度占優。本研究中，不同濕地單元的AOB與AOA存在一定的群落差異性，4單元和5單元、1單元和6單元在AOB菌群組成上較為接近，而6、7、8單元與其他單元之間AOA菌群組成存在較大差異。

氨氧化微生物的多樣性受沉積物多種環境因子的影響。AOB中豐度較大的Unclassified_o_Nitrosomonadales與pH值和NO-3-N含量呈正相關關系，其中與pH值的關系達到顯著水平。本研究中，人工濕地沉積物pH值為7.97～8.34，為堿性。AOA中Nitrososphaera與pH值、C/N比值呈正相關關系，與TC、TN、OM、NH+4-N、NO-3-N含量呈負相關關系。

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（責任編輯：張震林）