柚皮素脂質體對非酒精性脂肪性肝病大鼠脂質代謝的影響及機制研究*

唐曉飛，鐘夢菊，沈海娟

本研究觀察了柚皮素脂質體對非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)大鼠脂質代謝和肝組織病理學變化的影響，以期為NAFLD的治療提供幫助，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器、藥品與試劑 SPF級雄性SD大鼠50只，購自武漢華聯科生物科技有限公司【動物生產許可證號：SCXK(鄂)2015-0019】，晝夜交替周期為12 h，給予充足水和普通飼料，適應性飼養1 w。全自動生化分析儀(日本日立公司)、紫外分光光度計(上海光學儀器五廠有限公司)、酶標儀(上海閃譜生物科技有限公司)、電泳儀(武漢純度生物科技有限公司)。柚皮素及相應的柚皮素脂質體由上海機純實業有限公司提供。檢測試劑盒均購自上海閃譜生物科技有限公司。Nrf2 mRNA和β-actin均購自瑞士Roche公司，Nrf2 mRNA：正向TGAAGCTCAGCTCGCATTGA，反向TGCTCCAGCTCGACAATGTT；β-acton：正向TGAGCTGCGTTTTACACCCT，反向GCCTTCACCGTTCCAGTTTT。

1.2 模型構建 隨機將大鼠分為5組，即對照組、模型組、柚皮素組、柚皮素脂質體Ⅰ組和柚皮素脂質體Ⅱ組。除對照組大鼠不予特殊處理外，其余4組大鼠均采用高糖高脂飼料飼養12 w。在柚皮素組、柚皮素脂質體Ⅰ組和柚皮素脂質體Ⅱ組，分別給予柚皮素30 mg·kg-1.d-1、柚皮素脂質體20 mg·kg-1.d-1和柚皮素脂質體30 mg·kg-1.d-1腹腔注射；給予模型組大鼠等量生理鹽水腹腔注射。在12 w末，處死大鼠，取肝組織稱質量及行病理學檢查。

1.3 指標檢測 使用全自動生化分析儀檢測血生化指標；采用ELISA法檢測血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和丙二醛(malonaldehyde，MDA)水平；采用Western blot法檢測肝組織Nrf2蛋白表達，并采用RT-PCR法檢測肝組織Nrf2 mRNA水平。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量和肝質量比較 在12 w末，柚皮素組、柚皮素脂質體Ⅰ組和柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠體質量和肝質量均顯著低于模型組(P<0.05)；柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠體質量和肝質量均顯著低于柚皮素組和柚皮素脂質體Ⅰ組(P<0.05，表1)。

表1 各組大鼠體質量和肝質量比較

與對照組比，①P<0.05；與模型組比，②P<0.05；與柚皮素組比，③P<0.05；與柚皮素脂質體Ⅰ組比，④P<0.05

2.2 各組肝組織學變化 對照組大鼠肝細胞排列緊密，細胞內未見脂肪顆粒；模型組大鼠肝細胞大小不一，有大量脂肪顆粒沉積，且伴有炎性細胞浸潤；柚皮素組和柚皮素脂質體Ⅰ組大鼠肝細胞脂肪顆粒較小，存在較輕的炎性細胞浸潤；柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠肝細胞排列緊密，細胞大小均一，與對照組大鼠肝組織學表現相近(圖1)。

2.3 各組血生化指標比較 柚皮素組、柚皮素脂質體Ⅰ組和柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠血清TC、TG、ALT和AST水平均顯著低于模型組(P<0.05)；柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠血清TC、TG、ALT和AST水平均顯著低于柚皮素組(P<0.05，表2)。

圖1 各組大鼠肝組織病理學表現 (HE，400×)

例數TC(mmol/L)TG(mmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)對照組100.8±0.11.8±0.240.0±6.3133.4±8.4模型組101.2±0.2①2.6±0.2①69.8±5.3①229.6±18.2①柚皮素組101.0±0.1①②2.2±0.1①②52.6±5.2①②156.8±11.2①②柚皮素脂質體Ⅰ組100.9±0.1①②2.1±0.2①②③51.5±4.8①②149.4±9.9①②柚皮素脂質體Ⅱ組100.8±0.1②③1.9±0.1②③④45.4±4.3①②③④143.6±6.5②③

與對照組比，①P<0.05；與模型組比，②P<0.05；與柚皮素組比，③P<0.05；與柚皮素脂質體Ⅰ組比，④P<0.05

2.4 各組血清SOD、CAT和MDA水平比較 柚皮素組、柚皮素脂質體Ⅰ組和柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠血清SOD和CAT水平顯著高于，而MDA水平顯著低于模型組(P<0.05)；柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠血清SOD和CAT水平顯著高于，而MDA水平顯著低于柚皮素組和柚皮素脂質體Ⅰ組(P<0.05，表3)。

表3 各組大鼠血清SOD、CAT和MDA水平比較

與對照組比，①P<0.05；與模型組比，②P<0.05；與柚皮素組比，③P<0.05；與柚皮素脂質體Ⅰ組比，④P<0.05

2.5 各組大鼠肝組織Nrf2蛋白表達情況比較 對照組、模型組、柚皮素組、柚皮素脂質體Ⅰ組和柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠肝組織Nrf2蛋白表達水平分別為(1.4±0.3)、(0.4±0.1)、(0.8±0.1)、(0.8±0.2)和(1.3±0.2)，差異有統計學意義(P<0.05)；柚皮素組、柚皮素脂質體Ⅰ組和柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠肝組織Nrf2蛋白水平均顯著高于模型組(P<0.05)，柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠肝組織Nrf2蛋白水平顯著高于柚皮素組和柚皮素脂質體Ⅰ組(P<0.05，圖2)。

圖2 各組大鼠肝組織Nrf2蛋白表達情況

2.6 各組大鼠肝組織Nrf2 mRNA水平變化比較 對照組、模型組、柚皮素組、柚皮素脂質體Ⅰ組和柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠肝組織Nrf2 mRNA水平分別為(1.0±0.1)、(0.4±0.1)、(0.7±0.1)、(0.7±0.1)和(0.9±0.1)，差異有統計學意義(P<0.05)。柚皮素組、柚皮素脂質體Ⅰ組和柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠肝組織Nrf2 mRNA水平均顯著高于模型組(P<0.05)，柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠肝組織Nrf2 mRNA水平顯著高于柚皮素組和柚皮素脂質體Ⅰ組(P<0.05)。

3 討論

隨著人們生活水平的改善、不良飲食習慣的盛行及生活節奏的加快，我國NAFLD的發病率逐年攀升，且有向年輕化趨勢發展，嚴重影響著人們的健康[1-4]。目前，關于NAFLD的預防、治療和發病機制的研究已成為近年來研究的熱點[5-7]。但至今，有關NAFLD的發病機制仍未完全闡明[8-10]。多數學者認同“二次打擊”學說，認為肝細胞內脂肪顆粒堆積，超出肝臟清除脂肪的能力時，肝臟細胞會發生氧化應激反應，進而出現胰島素抵抗、脂質過氧化及糖脂代謝紊亂等[11-13]。本文通過探討柚皮素脂質體對NAFLD大鼠的保護作用，以期為NAFLD的治療做出新的研究。

本研究用高糖高脂飼料飼養大鼠，經過12周飼養，檢測各組大鼠體質量、肝質量和血清TC、TG、ALT、AST水平，結果發現模型組大鼠體質量、肝質量和血清TC、TG、ALT、AST水平均顯著高于對照組，且經病理學檢查觀察肝組織結構，發現模型組大鼠肝細胞內有大小不等的脂肪顆粒堆積，炎性細胞浸潤，以上結果均表明NAFLD大鼠模型構建成功。通過腹腔注射柚皮素和柚皮素脂質體，發現柚皮素組、柚皮素脂質體Ⅰ組和柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠體質量、肝質量和血清TC、TG、ALT、AST水平均較模型組大鼠大幅降低，表明柚皮素可有效調節大鼠脂質代謝，保護肝臟，且柚皮素脂質體劑型效果更好，隨著給藥劑量的增加，其效果越明顯。近年來，有研究[14-16]發現Nrf2與NAFLD發病密切相關，其在NAFLD發病及疾病進展過程中發揮著重要的作用。

Nrf2是亮氨酸拉鏈轉錄因子家族成員之一，在機體內普遍存在，主要負責調控組織或細胞防御氧化應激，促進SOD和CAT等抗氧化因子的生成[17-20]。本研究結果表明模型組大鼠肝組織Nrf2蛋白表達較對照組降低，差異有統計學意義。經腹腔注射柚皮素和柚皮素脂質體后，大鼠肝組織Nrf2蛋白表達有不同程度的升高，以柚皮素脂質體Ⅱ組升高更為明顯。進一步采用RT-PCR法檢測大鼠肝臟Nrf2 mRNA水平，結果顯示模型組大鼠肝組織Nrf2 mRNA水平最低，而柚皮素組、柚皮素脂質體Ⅰ組和柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠肝組織Nrf2 mRNA水平均有不同程度的升高，且以柚皮素脂質體Ⅱ組升高更為明顯。通過檢測5組大鼠血清SOD、CAT和MDA水平，我們發現柚皮素組、柚皮素脂質體Ⅰ組和柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠血清SOD和CAT水平均顯著高于模型組，而血清MDA水平顯著低于模型組。以上結果提示，柚皮素可能通過激活Nrf2表達，促進SOD和CAT的生成，進而抑制肝細胞氧化應激損傷，發揮了保護肝臟的作用。