基因測序技術的選用與檢測報告解讀*

梁 晨，段鐘平，鄭素軍

近年來，基因測序技術已廣泛應用于遺傳性和病因不明疾病的診斷、無創產檢、臨床微生物的檢測、個體化用藥、腫瘤診治等方面[1, 2]。基因測序多由第三方檢測公司完成，這使得臨床醫師如何選擇恰當的基因檢測方法，并正確解讀檢測報告，顯得越發重要[3, 4]。既往該類工作多由具備遺傳學資質的醫師完成，然而其數量在世界范圍內均明顯缺乏[5, 6]。在臨床實踐中，多數臨床醫生常會面臨諸如目前有哪些常見基因測序技術、它們有哪些優缺點、如何恰當選用、如何準確理解檢測報告等問題[7]。基于此，本文將結合我們在遺傳代謝性肝病診療中的一些體會，對如上問題做一介紹。

1 三代測序技術的優缺點及應用選擇

1.1 第一代測序技術 1975年，Sanger發明了利用DNA聚合酶的雙脫氧核苷酸末端終止測序法(Sanger法)，第1代測序技術正式誕生[7, 8]。該方法對目標基因擴增后通過毛細管電泳讀取序列[9]。可用于未知或已知的基因變異的檢測，基本適用于所有的基因變異類型，如點變異、插入或缺失變異等，準確率幾乎100%，是測序技術的金標準。但其依賴于PCR擴增，只能逐段分析單個DNA片段，通量小。自動化程度低，測序成本高[3,8,10]。

1.2 第二代測序技術(next generation sequencing, NGS) 又被稱為高通量測序技術，可同時對幾百萬條DNA分子進行序列測定。根據測序覆蓋范圍，將其分為全基因組測序(whole gene sequencing, WGS)、全外顯子測序(whole exome sequencing, WES)和靶向區域測序(targeted /panel sequencing)[3, 11]。與第一代測序技術相比，NGS以高通量、高靈敏性、高準確性、自動化程度高、成本低廉為顯著特征，合成與測序同時進行，可一次性檢測未知物種、未知基因全基因組區域的所有位點。但該技術需要將基因組片段化，讀長(測序反應所能測得序列的長度，須將基因組分割為讀長以內的短序列才能測序)較短，不利于后續分析數據時信息的拼接整合，也不能捕獲所有的基因變異類型[3, 12]。WGS主要針對全基因組水平的變異進行檢測，可最大限度地覆蓋靶標，但費用昂貴，某些著絲粒區、端粒區和某些高GC含量區等特定區域，屬于測序盲區，數據可信度相對較差。目前，除應用于基因組拷貝數變異(染色體微小片段缺失或重復)等少數情況外，“原則上全基因組測序一般不用于臨床檢測[13]”，其臨床應用尚需進行前瞻性試驗以評估選擇WGS是否利大于弊[14-16]。

外顯子序列大概占到人類基因組序列的1%～2%左右[17]。由于遺傳性疾病基因變異主要發生在外顯子區域，且WES與WGS相比，數據分析量相對較小，成本相對較低，基因型-表型關系更直接，可一次性捕獲約20000個與人類疾病相關的基因，在遺傳性疾病診斷方面得到了更為廣泛應用。例如對孕婦和胎兒進行WES檢測，可為孕婦及其家庭提供優生優育咨詢等服務[18, 19]。通常，靶向區域測序是對可引發某種臨床表現(即表型)的多種可能性致病基因進行測序。與WES相比，在同等數據量的情況下，靶向測序對目標序列的覆蓋率可達99%以上，甚至100%，平均測序更深，靶向區域測序在數據質量方面優于全基因組或全外顯子測序[12, 16]，提高了表型相關致病基因變異的檢出率，且檢測及數據分析成本減小，診斷時間縮短。

1.3 第三代測序技術 第三代測序技術是在單分子和單細胞水平對基因組進行測序的技術[20]，測序速度快，每秒讀取堿基數可達10個，其理論讀長可達10 kb，甚至可以無限長。不需要PCR擴增，檢測精度明顯提高[21]，適用于測序要求高的全基因組測序、甲基化研究、RNA測序、基因的重復序列(例如polyA尾)和癌癥的診治等[22, 23]。但該方法成本高，通量及準確性相對低，目前多應用于科研領域，對遺傳性疾病的檢測并非首選[24, 25]。

1.4 基因測序方案的選擇 臨床上，應結合患者臨床特征和不同測序技術的優缺點，來恰當選擇檢測方法[7]。針對臨床表現高度疑似某種單基因病、有常見致病變異位點時，可應用一代測序(例如以非溶血性間接膽紅素升高為主要表現，懷疑Gilbert綜合征時，常見變異包括A(TA)7TAA、c.211G>A，-3156G>A和-3279T>G等)。對于臨床表型相對復雜、鑒別診斷的范圍較廣而有一定困難時(例如主要表現為黃疸、脾腫大、貧血，不能排除Gilbert綜合征與遺傳性球形紅細胞增多癥等血液系統疾病共存時)，可以采用全外顯子測序；對于有相同或相似臨床表現的一組遺傳代謝性疾病，例如膽汁淤積癥，可采用靶向區域測序，對進行性家族性肝內膽汁淤積癥(PFIC1-5型)、良性復發性肝內膽汁淤積癥(BRIC1-2型)、先天性膽汁酸合成障礙、Alagille綜合征、Niemann-Pick病(C1/C2型),Zellweger 綜合征等過氧化物酶病等多種疾病的致病基因實現靶向測序，以增加診斷的敏感度和準確性[16, 17]。目前，全基因組測序和第三代測序，除少數用于懷疑基因組結構改變引起的疾病或待檢樣本不易獲取、量少等特殊情況外，目前更多用于科學研究[7]。

2 基因檢測報告解讀

2.1 檢測報告的生成 以二代測序為例，測序數據經與人類基因組序列比對分析，對檢出的變異位點可借助比對疾病數據庫/群體數據庫，例如人類基因數據庫(HGMD)、美國國家生物信息學中心ClinVar、千人組計劃(1000genomics)等，以及參考已發表的文獻，來判定基因變異的臨床意義。同時，運用基因分析軟件，如PolyPhen-2、SIFT、MutationTaster、Provean、GeneSpilcer等，預測相應變異對蛋白質功能和結構的影響[26]。最后，用Sanger測序驗證與表型可能相關的變異，并結合患者表型特征和臨床檢查結果、家族史、遺傳方式等信息，按照美國醫學遺傳學與基因組學學會(the American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)制定的測序變異的解讀指南，得出基因變異的致病性判斷[16, 27]。

2.2 檢測報告的常見內容 一份正規的檢測報告，常由報告正文和附錄兩部分組成。正文的重要內容包括檢測結果以及對結果的解讀。附錄常列出此次檢測的補充信息，如檢測基因的范圍、基因對應疾病的背景知識、檢測方法的細節、檢測的局限性、質控數據和附圖等。

2.2.1 檢測結果 以ACMG指南為標準[27]，常包括變異基因名稱、染色體編號和坐標、核苷酸變異、氨基酸變異、等位基因雜合性、變異的致病性、參考文獻等。現對報告中涉及的相關內容分別說明如下(以ATP7B基因為例)。

基因名稱：原則上列出的是美國國家生物技術信息中心(NCBI)上的官方命名[16]，在染色體上的位置是絕對固定的，如ATP7B基因位于13號染色體長臂1區4帶3亞帶(13q14.3)[28]。對于DNA及氨基酸水平的變異，采用不同命名方式，例如g.代表基因組序列，c.是指編碼DNA序列，p.代表氨基酸序列，m.是指線粒體相關序列[27]。

基因變異類型：主要包括：①點變異：單個堿基改變，如ATP7B基因c.2333G>T，表示在編碼區2333位的堿基由G變異為T；IVS18+6C>T，表示該基因內含子18的第6位堿基C變異為T；②移碼變異：在DNA的堿基組成中缺失或插入一個或幾個堿基對，如插入變異-129_-128insGCCGC，表示從非編碼區128位置到129位置插入GCCGC。

基因變異導致氨基酸改變類型：主要有，①錯義變異：單個堿基變異造成該位置氨基酸變化，如c.2333G>T對應的氨基酸變化p.R778L，表示ATP7B編碼的氨基酸第778位置上精氨酸(單字母縮寫為R)變異為亮氨酸(L)；②同義變異:堿基發生變異，但編碼的氨基酸未發生改變,如p.L770L，表示770位置上的亮氨酸未發生改變；③無義變異：堿基變異使編碼氨基酸的密碼子變異為終止密碼子，使肽鏈的合成提前終止(用X表示)，如p.Q111X，表示編碼111位置上谷氨酰胺(Q)的密碼子變異為終止密碼子；④移碼變異：是指在某位點插入或缺失3N+1個堿基后，該位點及之后的的氨基酸序列發生明顯改變。如p.V1146A fs*6，表示1146位置上氨基酸由纈氨酸(V)變異為丙氨酸(A),自該位點后移碼(fs)并翻譯5個氨基酸就終止了；⑤剪接位點變異：因影響DNA的轉錄過程，導致轉錄產物 mRNA 序列的異常，從而導致蛋白序列的異常。需要注意的是，同義變異常不致病，而無義變異、移碼變異，特別是起始密碼子變異、單個或多個外顯子缺失、經典±1或2的剪切變異，常導致蛋白無功能，在致病性證據級別上歸為非常強。

遺傳方式：根據變異基因所在染色體類型(常染色體或性染色體)及遺傳方式(顯性或隱性)的不同，分為常染色體顯性遺傳(autosomal dominant inheritance，AD)、常染色體隱性遺傳(autosomal recessive inheritance，AR)、性連鎖遺傳：X連鎖顯性遺傳(X-linked dominant inheritance，XLD)、X連鎖隱形遺傳(X-linked recessive inheritance，XLR)和Y連鎖遺傳和線粒體基因母系遺傳等。如ATP7B基因變異引起的Wilson病屬于AR[28]。需要指出的是，一種疾病有可能有多種遺傳方式。

等位基因(allele) 指位于一對同源染色體(分別來源于父母)相同基因位置上控制同一性狀的基因。對于常染色體上的變異，當一對等位基因相同位置上都發生變異時稱為純合變異(Hom)；一對等位基因中只有一個基因發生變異時，稱為雜合變異(Het)。對于僅有1條X染色體的男性來說，Y染色體上缺少與之對應的等位基因，故男性僅有等位基因中的1個成員，稱為半合子(Hemi)。復合雜合變異是指在由父母雙方遺傳來的一對等位基因中，其中一個等位基因上發現了變異，另一個等位基因的不同基因位點也發生了變異。需指出的是，對于AD，理論上只要有一個雜合的高危害性變異就能致病。但如果是AR，只有兩個等位基因都存在有害變異，也就是純合或者復合雜合時才能致病。對于XLR，男性半合子即可發病。

變異位點的致病性：2015年，ACMG和美國分子病理學會(the Association for Molecular Pathology，AMP)聯合提出了詳細的等級評定標準，可分為致病、疑似致病、臨床意義未明、疑似良性、良性5個等級[27]。一般來講，當變異認定為致病、疑似致病時，其臨床意義較大，但仍需結合臨床、遺傳方式和家族史來綜合判斷。而報告中列出的參考文獻常有助于進一步了解該位點的致病性。應注意的是，部分文獻變異位點的研究方法、檢測范圍可能存在缺陷，并沒經過功能驗證，不能簡單地認為文獻報道在患者中檢出的變異就是致病變異[29]。同時，對于臨床意義未明的變異，需要綜合參考軟件預測及人群頻率注釋信息，隨著基因不斷被報道及遺傳學證據的累積，將來也可能轉為致病等級[27]。

2.2.2 報告解讀及附錄 報告解讀是針對實驗結果的解釋。它常常包括變異位點致病性的證據，例如檢測所發現的變異是否全部或部分地解釋患者的臨床表型、是否有文獻報道、用軟件對編碼蛋白的功能影響預測等。同時，一些優秀報告還包括對臨床醫生的建議，這些建議包括一些需補充的臨床檢測，如對患者進行細胞酶學/功能的檢測，以及對患者家系其他成員進行變異檢測，以便為進一步解讀變異檢測結果提供支持[27]。

報告的附錄部分會提供很多檢測的細節，例如檢測基因的范圍、對應疾病的背景知識、檢測方法細節、檢測的局限性、質控數據及附圖等，了解這些有助于對檢測結果做出更好的解釋。例如應了解檢測覆蓋的范圍，采用的是全基因組、全外顯子組檢測，還是基因靶向測序。靶向區域測序要注意公司提供的基因檢測范圍是否包含臨床疑似疾病的致病基因，以免造成漏檢[12, 16, 17]。

3 基因檢測在遺傳代謝性肝病診斷中一些應用體會

3.1 送檢信息要全面，表型要準確 細致可靠的患者基本信息、臨床表型、常規檢查結果及家族史是診斷遺傳病的基礎，也是解讀基因檢測結果的依據[30]。在二代測序數據分析中，檢測機構常會重點分析與患者表型可能相關的基因是否存在致病性變異。若送檢單中臨床表型提供不準確，有可能導致基因檢測結果與臨床表型或診斷不符，使臨床醫師難以采信檢測的結果。為避免非專業表型表述，建議使用中文人類表型標準術語(Chinese Human Phenotype Ontology，CHP)(可登陸http：//www．Chinahpo.org/在線搜索)。同時，患者的年齡和性別對于疾病的表型、性連鎖疾病等會有提示作用：家族史常提示遺傳方式，準確的家族史有助于給數據分析提供方向[27]。

3.2 送檢標本最好包括一代親屬，尤其是父母親 通過家系的共分離分析，有利于提高發現致病基因變異的陽性率，也有助于過濾掉非致病變異，使檢測結果更精準。所謂遺傳學共分離原則，是指由于表型和基因型的連鎖綁定，在一個家系里，患者和非患者在致病變異位置上的基因型一般是不同的[27]。例如對于AR遺傳病，患者是純合或復合雜合基因型，父母各自攜帶一個致病等位基因。如果僅檢測患者本人，是無法判定復合雜合變異的。相反，AR遺傳病患者基因上發現一個純合變異，如果父母任何一方也是純合基因型但無臨床表型，則該變異的致病性可能很小。對于AD遺傳病，患者是雜合基因型，理論上其父母之一也應當是患者。根據這一原則，AD遺傳病患者基因上發現的雜合變異，在外顯率為100%的情況下，如果父母都未患病且不攜帶此變異，則可確認其為新發變異。

3.3 不能將基因檢測作為診斷的唯一標準 假陽性可由檢測方法本身缺陷所致，也可以由報告閱讀者“誤判”所致。前者例如WES測序在外顯子捕獲、PCR擴增、重新拼接過程中可能出現錯誤而檢出“基因變異”，該情況盡管少見，但若報告中未提示該結果是否經過一代測序驗證，且不能解釋患者臨床表現時，則應警惕假陽性問題。誤判主要由解讀不當引起。例如僅檢測到UGT1A1基因c.211G>A單位點雜合變異，在檢測報告中常標識為致病性，此時若解讀不當，則可能誤診為Gilbert綜合征，導致疾病診斷的“假陽性”。其實，在我國正常人群中，該基因變異攜帶率高達10%，我們前期小樣本研究顯示，在總膽紅素<17.1μmol/L的健康體檢人群中，c.211G>A基因頻率高達29.1%。既往也曾有病例報道，對Wilson先證者的親屬進行基因篩查發現，其兄弟姐妹即使存在相同的純合或復合雜合變異位點，也有可能終生不發病[29]。單純依靠基因檢測結果，也可能造成疾病診斷的“假陽性”。基因變異與臨床表型的相關性還受到宿主本身(例如體內激素水平、年齡、性別)、修飾基因、外界環境、甚至藥物的影響。故檢測結果也需要與患者具體臨床表現結合起來，最終做出準確診斷并制定相應的處理措施。

由于檢測方法及數據質量存在的固有缺陷，使得本來存在的致病性變異未檢出，可產生假陰性問題。例如采用全外顯子測序，則針對增強子、啟動子、內含子以及由于外顯子和內含子的拼接區的變異覆蓋不到而無法檢出，出現假陰性。例如UGT1A1基因的增強子區-3279位點、啟動子區的TA變異，常常是Gilbert的致病位點，采用全外顯子測序就不能檢出，而應用一代測序則可有效檢測出該位點。當WGS需進行捕獲雜交時，對于檢出的大片段的基因缺失，很難判斷是因為雜交沒有捕獲到，還是真的缺失。再例如靶向區域測序，由于所測基因由檢測機構自行確定，其中若沒有包含疑似疾病的真正致病基因，也可以導致檢測陰性[17]。所以，再次強調所有測序方案都不是萬能的，都有其優缺點及適用范圍，不是二代測序就一定比一代測序好，檢測不出變異也不能完全排除疾病。只有掌握測序機理和優缺點，才能面對檢測結果，做到正確解讀[7]。若發現基因檢測結果與臨床不符時，建議加強臨床和實驗室之間的溝通和互動，也是一種增加診斷成功率的好方法。必要時，可向第三方檢測公司索要檢測的原始數據進行再分析，尤其在檢測結果為陰性或意義未明時[27]。