卡托普利對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠肝細(xì)胞脂肪變性的影響*

唐新亞，侯 森，焦?fàn)I營(yíng)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)以彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)沉積為主要病理，且無(wú)過(guò)量飲酒史。據(jù)報(bào)道，西方國(guó)家普通人群NAFLD患病率高達(dá)20%～30%，國(guó)內(nèi)患病率類似。NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，可能與環(huán)境、遺傳、生活方式等因素密切相關(guān)[1，2]。目前，“二次打擊”學(xué)說(shuō)已被認(rèn)為是解釋該病發(fā)病機(jī)制較為成熟的觀點(diǎn)，胰島素抵抗(IR)會(huì)誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性，致使肝臟脂肪沉積，以線粒體反應(yīng)氧體系為核心的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化會(huì)加重肝臟損傷，引起肝臟炎癥反應(yīng)。肝臟炎癥持續(xù)存在，誘導(dǎo)細(xì)胞因子和其它因素綜合作用，促使炎癥進(jìn)展為肝組織壞死及纖維化，形成炎癥、壞死惡性循環(huán)[3，4]。有報(bào)道認(rèn)為，以肝組織細(xì)胞色素氧化酶P4502E1(cytochrome P4502E1，CYP2E1)為中心產(chǎn)生的氧自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化會(huì)誘導(dǎo)肝實(shí)質(zhì)損害，在非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[5]。卡托普利屬血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，已被用于治療高血壓和紫癜性腎炎等疾病，在改善血糖代謝、增加胰島素敏感性、抗氧化應(yīng)激、緩解放射性肺損傷等方面療效顯著[6，7]。本研究探討了卡托普利對(duì)NAFLD大鼠肝細(xì)胞脂肪變性的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與儀器 健康雄性SD大鼠64只，SPF級(jí)，鼠齡為3～6個(gè)月，體質(zhì)量130～160 g，由湖北省疾控中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼料級(jí)膽酸鈉、飼料級(jí)膽固醇(安徽天啟化工科技有限公司)；卡托普利(四川太平洋藥業(yè)有限責(zé)任公司)；羅格列酮(太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司)；檢測(cè)丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)試劑盒(北京邦定生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)，檢測(cè)谷胱甘肽(glutathione，GSH)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，檢測(cè)血生化試劑盒(上海百祥生物科技有限公司)；TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒、總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司)；檢測(cè)肝組織CYP2E1引物(美國(guó)Santa Cruz公司)；DXC800型全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)；DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)；720型超低溫冰箱(Thermo Scientific公司)；722型分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司)；Spectra Max M3酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司)；ABI-7300熒光定量PCR檢測(cè)儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)中國(guó)公司)；Gel DocTMEZ成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.2 NAFLD大鼠模型的建立 隨機(jī)將64只大鼠分為4組，給予對(duì)照組普通飼料喂養(yǎng)，給予其他組高脂飼料(87.8%普通飼料+10%豬油+0.2%膽酸鈉+2%膽固醇)喂養(yǎng)，制備NAFLD大鼠模型。在造模第6 w，明確模型建立后，分別給予動(dòng)物10 ml·kg-1生理鹽水(模型組)、卡托普利0.7 mg.100 g-1(卡托普利處理組)、羅格列酮0.047 mg.100 g-1(羅格列酮處理組)灌胃。持續(xù)給藥6 w，所有大鼠禁食12 h，給予1%戊巴比妥鈉0.4 ml.100 g-1腹腔注射麻醉，處死動(dòng)物，取血和肝臟，稱量肝濕質(zhì)量，計(jì)算肝指數(shù)(=肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量)。按組織質(zhì)量(g)∶乙醇體積(m1)=1∶9的比例，加入無(wú)水乙醇，冰水浴下勻漿、離心，收集上清液并保存。另留取部分肝組織，4%甲醛固定，行肝組織病理學(xué)檢查，將剩余的肝組織置入凍存管，置于液氮中短期保存。

1.3 肝組織CYP2E1 mRNA水平檢測(cè) 取肝組織0.1 g，于液氮中磨碎，提取總RNA，測(cè)定總RNA濃度和純度，確保D260/D280≥1.8。合成TIANScript cDNA第一鏈，行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，分別加入CYP2E1和GAPDH基因引物行PCR反應(yīng)，于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)照相，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 對(duì)照組肝細(xì)胞未見(jiàn)炎癥反應(yīng)，無(wú)變性及壞死；模型組肝細(xì)胞體積增大，見(jiàn)廣泛性脂肪變性和細(xì)胞水腫；卡托普利處理組大部分肝細(xì)胞排列正常，可見(jiàn)少量脂肪變性，部分細(xì)胞水腫；羅格列酮處理組肝組織病理學(xué)變化類似于卡托普利處理組，但細(xì)胞內(nèi)脂滴較大，數(shù)量略增多(圖1)。

圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE， 200×) A：對(duì)照組，肝細(xì)胞正常，無(wú)炎癥反應(yīng)；B：模型組，肝細(xì)胞廣泛性脂肪變性，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)；C：卡托普利處理組，肝細(xì)胞脂肪變性和炎癥程度明顯減輕；D：羅格列酮處理組，肝細(xì)胞脂肪變性和炎癥程度明顯減輕

2.2 各組大鼠血清AST、ALT、TC、TG水平比較 模型組血清AST、ALT、TC、TG顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；卡托普利處理組、羅格列酮處理組血清AST、ALT、TC、TG顯著低于模型組(P<0.05，表1)。

表1 各組大鼠血清指標(biāo)比較

與對(duì)照組比，①P<0.05；與模型組比，②P<0.05

2.3 各組大鼠肝組織肝濕重和肝指數(shù)比較 模型組、卡托普利處理組和羅格列酮處理組肝濕重、肝指數(shù)和肝組織CYP2E1 mRNA水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而卡托普利和羅格列酮處理組肝濕重和肝指數(shù)顯著低于模型組(P<0.05，表2)。

表2 各組大鼠肝濕重和肝指數(shù)比較

與對(duì)照組比，①P<0.05；與模型組比，②P<0.05

2.4 各組大鼠血清MDA和GSH水平比較 模型組血清MDA水平顯著高于，而血清GSH水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，卡托普利和羅格列酮處理組血清MDA顯著低于，而血清GSH水平顯著高于模型組(P<0.05，表3)。

表3 各組大鼠血清MDA和GSH水平比較

與對(duì)照組比，①P<0.05；與模型組比，②P<0.05

3 討論

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)非酒精性脂肪性肝病患病率呈逐年增長(zhǎng)且年輕化趨勢(shì)，病因復(fù)雜，是多方面因素綜合作用的結(jié)果，其中RI、活性氧簇和氧應(yīng)激、脂質(zhì)過(guò)氧化損傷、脂肪細(xì)胞因子、與脂肪酸代謝相關(guān)的細(xì)胞因子等在其發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[8，9]。目前，該病尚無(wú)特效治療，主要以運(yùn)動(dòng)、飲食和行為療法為主，藥物治療為輔，需要綜合性長(zhǎng)期治療。卡托普利作為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑的代表藥，已被證實(shí)在原發(fā)性高血壓、充血性心力衰竭、急性肺栓塞等疾病治療中發(fā)揮著重要的作用，在治療大鼠肝損傷方面也具有顯著的療效，但目前鮮有報(bào)道分析卡托普利對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠肝細(xì)胞脂肪變性的影響[10-12]。

本研究模型組肝濕重和肝指數(shù)增大，血清AST和ALT上升，血清TC和TG上升，血清MDA增多和血清GSH減少。在光鏡下觀察病理學(xué)表現(xiàn)發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肝細(xì)胞體積增大，伴細(xì)胞水腫，肝細(xì)胞脂肪變，證實(shí)非酒精性脂肪性肝病大鼠造模成功。

本研究卡托普利處理組和羅格列酮處理組血清AST、ALT、TC和TG明顯低于模型組，與既往報(bào)道[13]相似，預(yù)示卡托普利可降低血清AST、ALT、TC和TG水平。非酒精性脂肪性肝病大鼠接受卡托普利干預(yù)后肝細(xì)胞損傷減輕，肝臟功能獲得明顯的改善，其機(jī)制可能是對(duì)肝細(xì)胞膜功能恢復(fù)有顯著的改善作用14，15]。卡托普利可通過(guò)減少非酒精性脂肪性肝病大鼠脂質(zhì)在肝細(xì)胞內(nèi)的合成和沉積，改善脂代謝紊亂。本研究卡托普利處理組和羅格列酮處理組肝組織肝濕重和肝指數(shù)明顯低于模型組，卡托普利處理組動(dòng)物大部分肝細(xì)胞排列正常，可見(jiàn)少量的脂肪變性和部分細(xì)胞水腫，證實(shí)卡托普利干預(yù)后肝細(xì)胞脂肪變性明顯改善，肝臟脂質(zhì)沉積狀況減輕。

本研究卡托普利處理組和羅格列酮處理組血清MDA明顯低于模型組，而血清GSH水平顯著高于模型組，證實(shí)卡托普利能有效減輕非酒精性脂肪性肝病大鼠機(jī)體氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化程度，與以往報(bào)道[16]相似。MDA具有細(xì)胞毒性，可誘導(dǎo)細(xì)胞膜通透性及流動(dòng)性改變，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能損傷，誘導(dǎo)致炎因子大量釋放，與Kupffer細(xì)胞共同作用介導(dǎo)肝損傷[17]。GSH屬低分子抗氧化劑，可清除體內(nèi)自由基，維護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及功能完整性，抗脂質(zhì)過(guò)氧化效果顯著，其血清含量反映了機(jī)體的抗氧化能力[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，卡托普利處理組和羅格列酮處理組肝組織CYP2E1 mRNA水平顯著低于模型組，表明卡托普利可經(jīng)誘導(dǎo)YP2E1 mRNA水平下調(diào)，調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化[19,20]。卡托普利可通過(guò)降低非酒精性脂肪性肝病大鼠CYP2E1蛋白表達(dá)水平，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化程度，緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善肝損傷。