兒童和青少年自身免疫性肝炎患者外周血淋巴細胞亞群變化及其臨床意義探討*

吳志敏，楊永煌，卞相麗

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)是一種進行性炎癥性肝病，在10～30歲女性中更為常見[1-3]。AIH的臨床特征是血液循環(huán)自身抗體，包括抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)、抗平滑肌抗體(anti-smooth muscle antibody，ASMA)等陽性。另外，AIH患者還表現(xiàn)為血清轉(zhuǎn)氨酶和免疫球蛋白水平升高。在組織學上出現(xiàn)肝再生，肝組織內(nèi)出現(xiàn)玫瑰花結(jié)樣改變、匯管區(qū)伴有大量淋巴細胞和漿細胞浸潤等典型特征[4]。AIH的臨床表現(xiàn)可從無明顯的癥狀到輕、重度肝炎，直至暴發(fā)性肝衰竭[5]。AIH的病因尚不清楚，可能與遺傳易感性、病毒感染或藥物應用等因素有關。AIH的易感性與主要組織相容性復合體II相關基因有關，特別是人類白細胞抗原(HLA)基因，包括HLA-DR3、HLA-DR4和HLA-DRB1*1301等[6]。AIH的病理生理學改變涉及淋巴細胞，主要是T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞等的活化[7]。免疫細胞的激活或功能狀態(tài)的改變可能導致免疫系統(tǒng)功能失衡，導致細胞因子的產(chǎn)生增加和調(diào)節(jié)機制紊亂[8]。本研究檢測了兒童和青少年AIH患者外周血淋巴細胞亞群的變化，旨在分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2015年6月～2019年1月我院收治的兒童和青少年AIH患者42例，男性14例，女性28例；發(fā)病年齡為[9.8(6.5，15.5)]歲。依據(jù)2008年國際AIH小組(IAIHG)提出的AIH簡化診斷積分系統(tǒng)，即≥7分確診為AIH[9]；對于懷疑但不能通過簡化診斷積分系統(tǒng)確診的病例，采用1999年IAIHG修正的AIH診斷評分系統(tǒng)診斷，即治療前≥16或治療后≥18分的患者被診斷為AIH[1]。排除標準：甲乙丙丁戊型病毒性肝炎、藥物性肝損傷、遺傳性肝病、巨細胞病毒或EB病毒感染。另選擇50例健康兒童和青少年作為健康人，男性20例，女性30例；平均年齡為(10.5±4.7)歲。本研究遵循赫爾辛基宣言的原則，并經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準通過。所有治療均獲得患兒法定監(jiān)護人的同意并簽署紙質(zhì)知情同意書。

1.2 外周血淋巴細胞亞群的檢測 采集外周靜脈血6 ml，采用乙二胺四乙酸抗凝，采用Ficoll密度梯度離心法分離并獲得單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。經(jīng)標記熒光素的單克隆抗體染色，上流式細胞儀檢測，獲得CD4+、CD8+和CD14+T細胞百分比和不同細胞表面標記物表達百分比。應用抗CD4-APCCy7、抗CD4-Cy7、抗CD8-FITC、抗CD8-APC、抗CD14-FITC、抗CD45RA-FITC、抗CD45RO-PE、抗CTLA4-Cy5、抗CD69-Cy7、抗CD28-PE、抗CD40L-Cy5、抗HLA-DR-Cy7、抗CD95L-PE、抗CD95-Cy5、抗CD25-Cy7、抗CCR3-PE、抗CCR5-Cy5、抗CD80-Cy5和抗CD86-APC。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血淋巴細胞百分比比較 AIH患者外周血CD4+T細胞百分比顯著高于健康人，CD14+T細胞百分比顯著低于健康人，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)，而兩組外周血CD8+T細胞百分比無顯著性差異(P>0.05，表1)。

表1 兩組外周血淋巴細胞百分比[%，M(P25，P75)]比較

與健康人比，①P<0.05

2.2 兩組外周血淋巴細胞表面標記物表達百分比比較 AIH患者外周血CD4+T淋巴細胞表面CD45RA、CD45RO、CCR3和CD28表達百分比顯著高于健康人(P<0.05，表2)；AIH患者外周血CD8+T淋巴細胞表面CD45RA、CCR3和CD25表達百分比顯著高于健康人(P<0.05)，CD45R0表達百分比顯著低于健康人(P<0.05，表3)； AIH患者其他細胞表面標記物與健康人比較未見顯著差異(P>0.05，資料未列出)；AIH患者外周血CD14+T淋巴細胞表面CD45R0表達百分比為 34.7(16.3，57.8)%，顯著低于健康人[82.1(73.2，89.7)%，P<0.05]。

表2 兩組外周血CD4+T淋巴細胞表面標記物表達百分比[%，M(P25，P75)]比較

與健康人比，①P<0.05

表3 兩組外周血CD8+T淋巴細胞表面標記物表達百分比[%，M(P25，P75)]比較

與健康人比，①P<0.05

3 討論

AIH在世界范圍內(nèi)均有發(fā)病，但發(fā)病率有種族和地域差異。通過對現(xiàn)有的研究報道進行檢索可知，國際上針對AIH報道的研究國家主要來自于日本。長期以來，在國內(nèi)AIH被認為是較為少見的一類疾病。隨著自身抗體檢測水平的不斷提高及臨床醫(yī)師對該病的認識逐步清晰，現(xiàn)如今國內(nèi)有關AIH病例報道的研究也在逐年增加。本組AIH患者一般臨床資料和實驗室檢查結(jié)果與其他研究結(jié)果類似[10-14]。據(jù)現(xiàn)有的流行病學研究，AIH在兒童、青少年和女性中相比其他群體發(fā)病率更高。AIH可分為急性起病和慢性發(fā)病兩種形式。自身抗體中以ASMA和ANA陽性最常見。研究表明幾乎所有的AIH患者血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高，凝血酶原時間延長。

本研究主要探討了AIH患者外周血CD4+、CD8+T細胞及其免疫表型標記物百分比的變化。與健康兒童和青少年相比，AIH患者外周血CD4+T細胞百分比升高。多項研究已經(jīng)證明了CD4+T細胞在AIH免疫應答中的作用[15-17]。在AIH組，我們觀察到CD14+T細胞百分比相對健康人降低，表明單核細胞的數(shù)量和活性增加，免疫調(diào)節(jié)機制受損。根據(jù)T細胞表達CD45分子的類別不同，可將淋巴細胞分為CD45RA+初始T細胞和CD45RO+記憶T細胞。在CD4+T淋巴細胞，AIH患者CD45RA+和CD45RO+均表達增加，提示AIH患者淋巴細胞被慢性和持續(xù)性激活。而在CD8+T細胞，AIH和健康人之間的CD45RA+和CD45RO+表達百分比并無顯著性差異，提示AIH患者并沒有CD8+T細胞記憶標記的激活。CCR3受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，CCR3受體的激活可促進炎癥反應，并與活性氧的釋放有關。自身免疫狀態(tài)可能與該受體的高表達存在某種關系[18，19]。測定原發(fā)性硬化性膽管炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化和自身免疫性肝炎患者26種趨化因子和細胞因子的血清水平，并與慢性丙型肝炎患者或健康人進行比較，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細胞趨化因子-3是在血管內(nèi)皮細胞中產(chǎn)生的一種趨化因子，負責將嗜酸性粒細胞趨化到炎癥部位，可以與CCR3相結(jié)合，暗示了嗜酸性粒細胞的過敏現(xiàn)象在AHI發(fā)病過程中所具有的潛在作用，這可能將嗜酸性粒細胞定義為肝臟特異性過敏性疾病，從而通過阻斷這些疾病相關免疫調(diào)節(jié)劑的作用而開辟潛在的新的治療途徑[20]。與正常人群和慢性肝炎患者相比，AIH患者血清趨化因子-3顯著升高，其高度表達似乎是AIH重要的特征，表明了上皮細胞可以在調(diào)節(jié)病理性T細胞介導的黏膜炎癥中發(fā)揮作用。在本研究中，可以發(fā)現(xiàn)AIH患者CD4+和CD8+T細胞表達CCR3均顯著高于健康人。CCR3可能是一個潛在的治療靶點，對它進行進一步研究具有十分重要的意義。CD28是激活幼稚T細胞、促進T細胞增殖、細胞因子產(chǎn)生和調(diào)節(jié)長效T細胞存活的主要刺激信號。在我們的研究中，發(fā)現(xiàn)CD28在CD4+T細胞表面表達在AIH患者比健康人增加。CD4+T細胞表面CD28表達的增加可能表明AIH患者對皮質(zhì)類固醇治療有更好的反應。CD25具有誘導細胞死亡和發(fā)揮調(diào)節(jié)性T細胞和效應性T細胞的作用，被認為是T細胞增殖的重要調(diào)節(jié)因子。CD25在免疫調(diào)節(jié)過程中的作用可能依賴于局部炎癥環(huán)境，后者可能調(diào)節(jié)細胞表面CD25分子的表達并誘導其在免疫應答反應中的作用。在AIH等活動性疾病患者，調(diào)節(jié)性T細胞的表達頻率較高，并與患者肝臟的炎癥活動度相關。研究認為AIH患者循環(huán)Treg細胞的頻率和功能不會受到影響[15]。也有人報道在自身免疫性肝病患者，Treg細胞頻率與患者肝臟疾病活動度參數(shù)成反比，并不會受到免疫抑制治療的影響。真正的Tregs細胞則會產(chǎn)生較少的IL-10，并能夠抑制靶細胞的增殖。研究表明在AIH患者調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)量和功能受到了損害。我們觀察到AIH患者CD8+T細胞表面CD25+表達明顯高于健康人。我們還評估了HLADR的表達情況。HLADR是兒童AIH的易感因素，但很少有研究說明其在細胞表面的表達情況。在本研究，AIH患者HLADR表達較少。有學者在評估患有AIH的兒童和青少年時報道了類似的結(jié)果。我們認為HLADR的低水平表達可能導致AIH患者對自身抗原的耐受性減弱。

在本研究中我們探討了兒童和青少年AIH患者復雜的淋巴細胞免疫表型變化及其意義，AIH患者肝內(nèi)持續(xù)的炎癥反應與外周血CD4+和CD8+T淋巴細胞表面CCR3、CD45RA/RO、CD25和單核細胞表面的HLADR表達有關，表明細胞水平的免疫系統(tǒng)激活或功能狀態(tài)的改變，繼而引起細胞因子產(chǎn)生增加和調(diào)節(jié)機制喪失，在AIH的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的作用。本文未對AIH進行分型，可能影響了觀察結(jié)果。外周血淋巴細胞表面免疫分子表達的變化及其臨床意義還需要進一步研究。