慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者血清IFN-γ基因多態(tài)性分析*

高朋彬，趙曉彥，王德華，秦 浩，孟明輝，張建集，閆雙緩，鄭歡偉

慢加急性肝衰竭((acute on chronic liver failure，ACLF)是指在慢性肝病基礎上出現(xiàn)急性肝損傷和肝功能失代償而導致的肝功能衰竭[1]。ACLF具有發(fā)病急、病情發(fā)展速度快，病情嚴重、治療困難且效果差、短期病死率高等特點，在臨床上受到廣泛的關注[2,3]。ACLF患者病死率高達50%～90%[4]。ACLF的病因較為復雜，在我國，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是導致ACLF的最主要的病因[5]。近年來，慢加急性乙型肝炎肝衰竭(HBV-ACLF)發(fā)病率逐年升高，部分地區(qū)HBV-ACLF在肝衰竭患者中占比已高達80%[6]。早期發(fā)現(xiàn)并采取積極的內科治療可使患者病情得到顯著的緩解[7,8]。HBV-ACLF的發(fā)病機制尚不完全明確，但多數學者認為機體免疫反應異常起到了重要的作用[9]。γ-干擾素(IFN-γ)是人體發(fā)生炎癥反應時重要的血清細胞因子，具有抗病毒、免疫調節(jié)和抗腫瘤等特征，在人體免疫防御過程中發(fā)揮重要的作用[10,11]IFN-γ還參與誘導干細胞凋亡等[12]。有研究證明，IFN-γ基因與免疫應答機制關系密切[13]。IFN-γ基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)可對細胞因子的轉錄、翻譯和表達過程造成影響，進而導致細胞因子含量及免疫功能的差異。因此，我們猜測IFN-γ可能與HBV-ACLF發(fā)生存在一定的病理生理學關聯(lián)。本研究檢測了HBV-ACLF患者外周血IFN-γ基因SNP位點+874T/A和+2109A/G基因型和等位基因分布特征，以期為及時準確地預測患者預后提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2017年5月～2019年9月我院診治的HBV-ACLF患者60例，男性38例，女性22例；年齡為24～76歲，平均年齡為(47.45±6.24)歲。診斷符合中華醫(yī)學會發(fā)布的《肝衰竭診治指南》的標準[14]。排除標準：(1)伴有嚴重的心、腦功能障礙；(2)伴有惡性腫瘤或嚴重的全身性疾??；(3)經影像學檢查發(fā)現(xiàn)存在肝硬化；(4)近期使用過免疫調節(jié)劑治療。另選擇我院同期健康體檢人群60例為對照組，男性39，女性21例；年齡為23～74歲，平均年齡為(46.78±6.35)歲。全部研究對象或家屬簽署知情同意書，本研究經過我院醫(yī)學倫理委員會審查。

1.2 基因提取和SNP位點基因分型檢測 空腹采集靜脈血5 mL，EDTA-K2或肝素抗凝，置于離心管中，加入TE 800μL混勻，在室溫下以12 000 r/m離心1 min，重復5～6次，直至完全溶解。再加入TE 400μL，10%SDS 25μL，20 mg/ml PK 5μL，37℃消化過夜。吸上層清液，加入等體積的酚，搖蕩15 min，以12000 r/min離心10 min，再次吸上層清液；加入等體積的酚：氯仿(1:1)，搖蕩15 min，以12000 r/min離心10 min，吸上清液；再加入等體積的氯仿，振蕩15 min，以12000 r/min離心10 min，吸上清液；加入兩倍體積的無水乙醇和1/10體積的3 M乙酸鈉，于-20℃下沉淀1 h，以12000 r/min離心10 min，棄上清液，向沉淀中加入75%乙醇，以12000 r/min離心5 min，棄上清液，干燥后用TE 100μL溶解，置于-20℃冷藏備用。使用羅氏LightCy-cler480實時熒光定量PCR儀，采用TaqMan探針熒光定量PCR法行IFN-γ SNP位點-159C/T基因分型(Taq-Man Genotyping Master Mix、TaqMan探針以及引物均購自美國ABI公司。PCR反應體積為10μL(引物見表1)，反應條件為95℃預變性10 min，92℃變性15 s、60℃退火1 min，共40個循環(huán)，40℃延伸5 min。應用羅氏LightCycler480熒光定量分析軟件LCS480 1.5.1.62對實驗數據進行基因分型。隨機對SNPs位點的不同基因型樣本進行測序，以驗證Taqman基因分型的結果。

表1 IFN-γ基因引物序列

1.3 肝腎功能指標檢測 使用Stago-Evolution血凝儀(法國Stago公司)及其配套試劑檢測凝血酶原時間(prothrombin time)，計算凝血酶原活動度(PTA)；使用日立7600全自動生化分析儀及其配套試劑檢測肝腎功能指標。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 21.0軟件處理數據，采用x2檢驗和Hardy-Weinberg平衡檢驗IFN-γ基因SNP位點+874T/A和+2109A/G基因型和等位基因頻率分布差異，采用Logistic回歸模型計算基因型和基因組模型OR值及其95%置信區(qū)間(CI)，以P<0.05為差異存在統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組人群基本特征 見表2。

2.2 兩組IFN-γ基因+874T/A多態(tài)性位點基因型和等位基因頻率分布比較 IFN-γ基因+874T/A位點存在TT、TA和AA三種基因型。ACLF患者與健康人基因型分布頻率存在顯著性差異(P<0.05)；在等位基因頻率分布結果中，ACLF患者T等位基因頻率顯著低于對照組，而A等位基因頻率顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05，表3)，提示T等位基因是患者發(fā)生HBV-ACLF的保護性基因，而A等位基因可能是患者發(fā)生HBV-ACLF的風險基因。

表2 兩組人群基本特征

表3 兩組IFN-γ+874T/A位點基因型和等位基因頻率分布(%)比較

SNPACLF(N=60)對照組(N=60)x2OR(95%CI)P+874T/A基因型TT29(48.3)34(56.7)TA12(20.0)18(30.0)6.0780.82(0.51～1.43)0.048AA19(31.7)8(13.3)等位基因T70(58.3)86(71.7)4.6890.61(0.42～1.15)0.030A50(41.7)34(28.3)

2.3 兩組IFN-γ基因+2109A/G多態(tài)性位點基因型和等位基因頻率分布比較 IFN-γ基因+2109A/G位點存在AA、AG和GG三種基因型。ACLF患者與健康人基因型分布頻率存在顯著性差異(P<0.05)；在基因型頻率分布結果中，ACLF患者顯性等位基因純合子AA基因型頻率顯著低于對照組，隱性等位基因純合子GG基因型頻率顯著高于對照組(P<0.05)；在等位基因頻率分布結果中，ACLF患者A等位基因頻率顯著低于對照組，G等位基因頻率顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05，表4)，提示A等位基因是患者發(fā)生HBV-ACLF的保護性等位基因，而G等位基因可能是患者發(fā)生HBV-ACLF的風險等位基因。

表4 兩組IFN-γ+2109A/G位點基因型和等位基因頻率分布(%)比較

SNPACLF(N=60)對照組(N=60)x2OR(95%CI)P+2109A/G基因型AA32(53.3)40(66.7)AG11(18.3)14(23.3)6.5100.73(0.28～1.46)0.039GG17(28.3)6(10.0)等位基因A75(62.5)94(78.3)7.2210.75(0.61～1.84)0.007G45(37.5)26(21.7)

3 討論

在我國，ACLF是最常見的肝衰竭類型，其中以HBV感染為病因的ACLF占絕大多數，可能系我國屬于HBV高發(fā)地區(qū)的原因[15]。肝移植是目前最有效的治療HBV-ACLF的方法，但其價格較為昂貴，且肝源無法滿足廣大患者的需求，且手術后需長期使用免疫抑制劑進行后續(xù)治療，因此肝移植治療的發(fā)展受到極大的限制。研究證明，早期發(fā)現(xiàn)并在合適的治療時機對HBV-ACLF患者采取合理有效的治療措施可大大緩解病情，甚至阻止疾病發(fā)展[7,8]。故及時準確地預測患者疾病進展的發(fā)生對降低HBV-ACLF發(fā)病率和病死率具有重要的臨床意義。

細胞介導的免疫反應參與了病毒的清除和疾病的發(fā)生發(fā)展過程。IFN-γ、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)等細胞因子與ACLF患者肝細胞壞死和預后密切相關[16]。在人體對于HBV的免疫應答機制中，Th1細胞是主要的介導細胞，促進機體清除HBV，在這個過程中，容易激發(fā)肝組織炎癥反應，誘發(fā)肝衰竭[17]。

IFN-γ是由巨噬細胞產生的細胞因子，可以活化T淋巴細胞，可激活單核巨噬細胞并誘導Th1細胞分化，使細胞毒性T淋巴細胞和效應T細胞活化，并通過活化的細胞毒性T細胞和效應T細胞殺滅病毒。鑒于IFN-γ在清除HBV過程中的重要作用，我們猜測IFN-γ水平與患者發(fā)生HBV-ACLF存在某種因果關系。隨著對人類基因研究的不斷發(fā)展，人們已經認識到不同的基因背景可以對不同人群和一些疾病產生影響。對于基因多態(tài)性的研究可以幫助我們了解不同基因型人群疾病發(fā)病率的不同，從基因水平去闡述HBV-ACLF的發(fā)病機制。近年來，細胞因子的基因多態(tài)性與疾病的易感性和臨床轉歸的研究受到了廣泛的關注。IFN-γ基因多態(tài)性與HBV感染有關[18,19]。IFN-γ基因位于人體第42號染色體上，跨度約為5.4 kb，由4個外顯子和3個內含子組成[13]。IFN-γ+874T/A位點中TT基因型能促使人體產生高水平的IFN-γ，有助于人體對病毒感染的免疫防御，而TA和AA基因型的表達則會導致人體IFN-γ水平降低，增加了病毒感染的風險[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，ACLF患者+874T/A位點TT基因型頻率顯著低于對照組，而A等位基因頻率顯著高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，提示+874T/A位點T等位基因是HBV-ACLF發(fā)生的保護性基因，而A等位基因是HBV-ACLF發(fā)生的風險基因。+874T/A和+2109A/G兩個SNP位點的DNA序列均是NF-kB信號通路的特異性結合位點，可能影響人體IFN-γ的表達，且該通路受到影響還會導致氧化損傷，提示+2109A/G位點也與人體IFN-γ的表達有關。本研究關于+2109A/G位點的研究結果發(fā)現(xiàn)，ACLF患者AA基因型頻率為53.3%，顯著低于對照組的66.7%，且ACLF患者A等位基因頻率為37.5%，顯著高于對照組的21.7%，差異均具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，驗證了我們的猜想。