參菊洗劑的抗過敏、止癢作用及急性毒性研究

張廣求，張美祥，譚 璐（黃岡市中心醫院，長江大學黃岡臨床醫學院，湖北 黃岡 438000）

參菊洗劑是黃岡市中心醫院根據臨床驗方研制的中藥制劑，主要由苦參、野菊花、黃柏、蛇床子等中藥組成，具有清熱解毒，祛風除濕，殺蟲止癢功效，用于濕毒所致的細菌性、真菌性、滴蟲性陰道炎及皮膚瘙癢癥的治療，具有較好的臨床療效[1]。前文[2-4]對參菊洗劑的體外抑菌、抗陰道毛滴蟲作用、皮膚安全性及陰道黏膜刺激性進行了實驗研究。本文以功能與主治基本一致的潔爾陰洗液作對照，采用2,4-二硝基氯苯（DNCB）致小鼠遲發型超敏反應模型，評價參菊洗劑的抗過敏作用；通過建立右旋糖酐40誘導的小鼠瘙癢模型、磷酸組胺誘導的豚鼠瘙癢模型，對該藥的止癢作用及其機制進行研究；采用小鼠進行經口急性毒性實驗，評價該藥的安全性，為臨床安全使用和進一步研究開發提供理論依據。

1 實驗材料

1.1 藥物及試劑

參菊洗劑（含生藥量為0.54 g·mL-1，黃岡市中心醫院自制，批準文號：鄂藥制字Z20180800，批號：180328，180415，180502）；潔爾陰洗液（含生藥量為1 g·mL-1，四川恩威制藥有限公司，批號：1704003）；0.9%氯化鈉注射液（武漢濱湖雙鶴藥業有限責任公司，批號：170401-0504）；DNCB（上海中泰化學試劑有限公司，批號：20170611），臨用前用丙酮配制成5%的致敏濃度和1%的激發濃度；右旋糖酐40（廣州市齊云生物技術有限公司，批號：CH0306B508Y）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20180322）；丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20180328）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：20180428）；磷酸組胺（美國SIGMA公司，批號：BCBN6122V）；硫化鈉、乙醚均為分析純。

1.2 實驗動物

KM小鼠，SPF級，雌雄各半，體質量18～22 g，由三峽大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（鄂）2017-0012。豚鼠，Dunkin-Hartley系，普通級，雌雄各半，體質量260～290 g，由湖北省實驗動物研究中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。使用許可證號：SYXK（鄂）2014-0083，實驗室內溫度（22±2）℃，相對濕度為（60±5）%。

1.3 儀器

ZH-YLS-Q4鼠耳打孔器（?8 mm，原陽縣振華教學儀器有限公司）；AL104型電子天平[梅特勒托利多儀器（上海）有限公司]；TGL-16G臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；Multiskan FC型酶標儀[賽默飛世爾（上海）儀器有限公司]；電子秒表；小鼠灌胃針。

2 方法

2.1 抗DNCB致小鼠遲發型超敏反應實驗

取小鼠50只，雌雄各半，隨機分為5組，每組10只。各組分別為：參菊洗劑低、中、高劑量組（濃度分別為10%、20%、40%，對應含生藥量分別為0.054、0.108、0.216 g·mL-1），10%潔爾陰洗液對照組（含生藥量為0.1 g·mL-1），模型對照組。于每只小鼠背部皮下各注射5% DNCB丙酮溶液20 μL致敏，并將小鼠腹部去毛3 cm×2 cm，分別將受試藥液或對照液均勻涂抹于脫毛區，模型對照組凃抹0.9%氯化鈉注射液，每只劑量均為0.1 mL，使各液與小鼠皮膚充分接觸，每日2次，每次間隔12 h，連續7 d。

末次給藥1 h后，分別以1% DNCB丙酮溶液均勻涂布在小鼠右耳廓的正反兩面激發過敏反應，每只20 μL，同時左耳涂等劑量丙酮溶液作為對照。涂耳24 h后，用乙醚淺表麻醉小鼠，進行頸椎脫臼處死，沿耳廓基線剪下雙耳，用鼠耳打孔器于左、右耳相同部位取下圓形耳片，準確稱重，以同一只小鼠兩耳片質量差值為腫脹度，計算各組腫脹度與腫脹抑制率（%）。腫脹度＝右耳片質量（mg）－左耳片質量（mg）；腫脹抑制率（%）＝[（模型對照組腫脹度均值－給藥組腫脹度均值）/模型對照組腫脹度均值]×100%。

仔細分離，摘取胸腺及脾組織，準確稱重，以10 g體重胸腺（脾）質量表示胸腺（脾）指數[胸腺（脾）指數=胸腺（脾）質量（mg）/體重（g）×10][5]。

2.2 抗右旋糖酐致小鼠全身瘙癢實驗

取小鼠50只，雌雄各半，隨機分為5組，每組10只。各組分別為：參菊洗劑低、中、高劑量組（含生藥量分別為0.054、0.108、0.216 g·mL-1），10%潔爾陰洗液對照組，模型對照組。各組小鼠腹部同一部位脫毛2 cm×2 cm，24 h后，分別將低、中、高劑量組的參菊洗劑或10%潔爾陰洗液20 μL，均勻涂抹于脫毛區，每日2次，每次間隔12 h，連續3 d，模型對照組涂抹相同劑量的0.9%氯化鈉注射液。末次給藥1 h后，于小鼠尾靜脈注射0.02%右旋糖酐40溶液0.1 mL，以小鼠出現前爪搔抓頭部、后爪搔抓軀干、嘴咬全身各部位作為瘙癢指征，觀察并記錄每只小鼠30 min內小鼠搔癢次數及搔癢持續總時間[6]。然后，用乙醚麻醉小鼠，眼眶靜脈取血，并頸椎脫臼處死。全血不加抗凝劑，靜置30 min，于3 000 r·min-1（r=10 cm）離心10 min，取上層血清，置4 ℃冰箱中冷藏，備用。按照試劑盒說明書操作，分別測定血清SOD活性及MDA、TNF-α水平。

2.3 抗磷酸組胺致豚鼠局部瘙癢實驗

取豚鼠50只，雌雄各半，隨機分為5組，每組10只。實驗前2 d，將各組豚鼠右后足背部剃毛2 cm×2 cm，分別將低、中、高劑量組的參菊洗劑（含生藥量分別為0.054、0.108、0.216 g·mL-1）或10%潔爾陰洗液均勻涂抹于剃毛區，每日2次，每次間隔12 h，連續用藥2 d，給藥量為1 mL·kg-1，模型對照組同時涂抹相同劑量的0.9%氯化鈉注射液。實驗當日，用320目細砂紙分別輕輕均勻擦傷剃毛處，使之發紅，以傷及表皮、不傷真皮、有輕度滲血但不出血為度，局部再涂受試藥液或對照藥液1次。涂藥后10 min，分別于創面處滴0.01%磷酸組胺溶液，每只50 μL，此后，每隔3 min依次遞增0.01%磷酸組胺的濃度：0.02%、0.03%、0.04%等，每次均為每只50 μL，直至出現豚鼠回頭口舔右后足，記錄所給予的磷酸組胺總量，作為致癢閾[6]。

2.4 小鼠口服給藥急性毒性實驗

根據文獻[7]，取小鼠40只，雌雄各半，隨機分為4組，每組10只。各組分別為：參菊洗劑低、中、高劑量組（濃度分別為20%、60%、100%即原液，對應含生藥量分別為0.108、0.324、0.540 g·mL-1），陰性對照組。實驗前禁食12 h，不限飲水，參菊洗劑低、中、高劑量組分別依次灌胃，陰性對照組以純化水灌胃，每只0.4 mL，共灌胃3次，每次間隔8 h。

灌胃給藥后2 h內，每15 min觀察1次；給藥后2～4 h內，每30 min觀察1次；給藥后4～8 h內，每2 h觀察1次；給藥后8～24 h內，每4 h觀察1次；以后每天早、晚各觀察1次，連續觀察14 d。記錄各組小鼠的外觀、行為活動、精神狀態、食欲飲水、大小便及顏色、皮毛、膚色、呼吸、有無分泌物[8]，有無眼瞼腫脹、瞳孔改變、結膜充血，記錄死亡時間、瀕死前反應等，于2、4、6、8、10、12、14 d分別稱重。實驗結束時，用乙醚淺表麻醉小鼠，進行頸椎脫臼處死和大體解剖，觀察并記錄心、肺、肝、胃、脾、腎、小腸、大腸的形態、質地和顏色。如有死亡或解剖發現器官異常病變，則進行組織病理學檢查。

2.5 統計學方法

實驗數據采用SPSS19.0統計學軟件進行分析，計量資料用均數±標準差表示，模型組與各劑量組間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 抗DNCB致小鼠遲發型超敏反應實驗

參菊洗劑低、中、高劑量組和10%潔爾陰洗液對照組的小鼠耳腫脹程度均明顯降低，與模型對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），且耳腫脹程度隨參菊洗劑的劑量增加而降低，呈現明顯的量效關系，表明參菊洗劑能抑制DNCB所致的小鼠遲發型超敏反應。參菊洗劑中、高劑量組還能增加胸腺和脾組織質量，升高胸腺指數和脾指數，且高劑量組更明顯，與模型對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 參菊洗劑對DNCB致小鼠遲發型超敏反應的影響.±s，n=10Tab 1 Effect of Shenju lotion on delayed hypersensitivity in mice induced by DNCB.±s，n=10

表1 參菊洗劑對DNCB致小鼠遲發型超敏反應的影響.±s，n=10Tab 1 Effect of Shenju lotion on delayed hypersensitivity in mice induced by DNCB.±s，n=10

注：與模型對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01Note: compared with the model control group，*P ＜0.05，**P ＜0.01

脾指數/mg·(10 g)-1參菊洗劑低劑量組組別 含生藥量/g·mL-1耳腫脹程度/mg胸腺指數/mg·(10 g)-1 0.054 2.92±0.97* 3.07±0.41 3.08±1.06參菊洗劑中劑量組0.108 2.13±0.49** 3.42±1.02 3.45±0.58參菊洗劑高劑量組0.216 1.02±0.33** 3.92±0.73* 3.79±0.65*10%潔爾陰洗液對照組0.100 2.19±0.38** 3.06±0.56 3.07±0.54模型對照組 – 4.57±0.63 3.16±0.89 3.01±1.17

3.2 抗右旋糖酐致小鼠全身瘙癢實驗

參菊洗劑各給藥組和10%潔爾陰洗液對照組均可明顯縮短右旋糖酐40所致的小鼠搔癢次數，搔癢持續總時間顯著縮短，與模型對照組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。參菊洗劑中、高劑量組和10%潔爾陰洗液對照組的SOD活性，與模型對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。參菊洗劑中、高劑量組和10%潔爾陰洗液對照組的MDA、TNF-α水平顯著降低，與模型對照組相比，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；參菊洗劑低劑量組的MDA、TNF-α水平，與模型對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

3.3 抗磷酸組胺致豚鼠局部瘙癢實驗

參菊洗劑低劑量組能提高磷酸組胺致豚鼠瘙癢的致癢閾，有抑制組胺引起的皮膚瘙癢作用，與模型對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。參菊洗劑中、高劑量組和10%潔爾陰洗液對照組的致癢閾，與模型對照組比較，差異有顯著統計學意義（P＜0.01），見表3。

表2 參菊洗劑對右旋糖酐致小鼠全身瘙癢反應的影響.±s，n=10Tab 2 Effect of Shenju lotion on systemic pruritus in mice induced by dextran.±s，n=10

表2 參菊洗劑對右旋糖酐致小鼠全身瘙癢反應的影響.±s，n=10Tab 2 Effect of Shenju lotion on systemic pruritus in mice induced by dextran.±s，n=10

注：與模型對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01Note: compared with the model control group，*P ＜0.05，**P ＜0.01

組別 含生藥量/g·mL-1 搔癢發作次數/次 搔癢持續時間/s SOD/U·mL-1 MDA/nmol·mL-1 TNF-α/pg·mL-1參菊洗劑低劑量組 0.054 12.8±3.97* 120.6±17.5* 088.26±2.86 5.94±0.89* 279.93±37.89*參菊洗劑中劑量組 0.108 08.9±2.85** 088.4±10.6** 106.63±3.17* 4.53±1.37** 238.22±16.63**參菊洗劑高劑量組 0.216 07.4±2.09** 078.1±8.09** 119.89±3.89* 4.06±0.96** 187.85±30.08**10%潔爾陰洗液對照組 0.100 08.6±2.49** 086.9±8.32** 103.37±2.16* 4.41±1.40** 230.81±24.46**模型對照組 – 16.2±2.38 197.3±16.7 077.24±1.84 7.95±1.85 351.60±19.05

表3 參菊洗劑對磷酸組胺致豚鼠局部瘙癢反應的影響.±s，n=10Tab 3 Effect of Shenju lotion on local itching reaction in guinea pigs induced by histamine phosphate.±s，n=10

表3 參菊洗劑對磷酸組胺致豚鼠局部瘙癢反應的影響.±s，n=10Tab 3 Effect of Shenju lotion on local itching reaction in guinea pigs induced by histamine phosphate.±s，n=10

注：與模型對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01Note: compared with the model control group，*P ＜0.05，**P ＜0.01

組別 含生藥量/g·mL-1致癢閾·磷酸組胺總量-1/μg P參菊洗劑低劑量組 0.054 088.73±24.52* ＜0.05參菊洗劑中劑量組 0.108 194.59±27.97** ＜0.01參菊洗劑高劑量組 0.216 376.92±35.04** ＜0.01 10%潔爾陰洗液對照組 0.100 320.77±28.23** ＜0.01模型對照組 – 035.26±18.24 –

3.4 小鼠口服給藥急性毒性實驗

連續觀察14 d，參菊洗劑各劑量組小鼠的精神、行為活動、肌肉運動、呼吸、對刺激的反應、皮膚毛發光澤、攝食、飲水、分泌物和排泄物等均無異常，無眼瞼腫脹、瞳孔改變、結膜充血，也無其他中毒反應和引起小鼠死亡，與陰性對照組比較無差異。參菊洗劑各劑量組小鼠的體重均有增長，與陰性對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。參菊洗劑低、中、高劑量組和陰性對照組小鼠的增長率分別為70.66%、71.65%、72.09%、71.52%，未出現體重明顯增加和減少，顯示體重變化趨勢正常，符合基本生長規律，未影響小鼠的生長。結果表明，參菊洗劑小鼠口服給藥基本無毒，見表4。

解剖檢查小鼠的上述各臟器形態、質地和色澤均正常，未見異常改變，且無性別差異。分別摘取心、肝、脾、腎進行稱重，同“2.1”項計算臟器指數。參菊洗劑各劑量組小鼠的心、肝、脾、腎指數，與陰性對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；參菊洗劑各劑量組的組間比較，差異也無統計學意義（P＞0.05），見表5。

4 討論

4.1 參菊洗劑的作用與毒性

研究結果表明，0.054、0.108、0.216 g·mL-1參菊洗劑可不同程度地抑制DNCB所致的小鼠遲發型超敏反應，0.216 g·mL-1劑量組能明顯升高胸腺指數及脾指數，提示參菊洗劑可能具有免疫調節作用。明顯減少右旋糖酐40所致的小鼠瘙癢發作次數和持續總時間，提高小鼠血清SOD活性（P＜0.05），降低MDA、TNF-α等炎癥因子的水平（P＜0.01或P＜0.05），表明參菊洗劑各給藥組具有較好的抗氧化、清除自由基及降低炎癥因子水平的能力。明顯抑制磷酸組胺致豚鼠局部瘙癢，提高致癢閾，量效關系明顯。參菊洗劑不含毒性中藥材，小鼠口服給藥急性毒性實驗證實，0.108、0.324、0.540 g·mL-1參菊洗劑在給藥后均未出現中毒反應和死亡。通過上述動物模型及多指標的評價方法，證實參菊洗劑外用具有抗過敏、止癢作用，小鼠口服給藥基本無毒。

4.2 參菊洗劑抗過敏作用機制

遲發型超敏反應是由T淋巴細胞介導的一種超敏反應，在機體接觸致敏源約24 h后才出現病變，屬Ⅳ型變態反應[5]。計算小鼠的胸腺指數和脾指數，可反映對機體免疫功能的影響。參菊洗劑的抗過敏作用可能與抑制T淋巴細胞，從而增強對超敏反應的耐受能力有關。

表4 參菊洗劑小鼠口服給藥急性毒性實驗對小鼠體重的影響.±s，n=10Tab 4 Effect of acute toxicity test of Shenju lotion on oral administration of mice on body weight of mice.±s，n=10

表4 參菊洗劑小鼠口服給藥急性毒性實驗對小鼠體重的影響.±s，n=10Tab 4 Effect of acute toxicity test of Shenju lotion on oral administration of mice on body weight of mice.±s，n=10

體重/g實驗前 2 d 4 d 6 d 8 d 10 d 12 d 14 d參菊洗劑低劑量組 0.108 20.14±0.82 21.57±1.17 23.07±0.96 24.33±1.25 25.75±1.30 27.46±1.04 28.93±1.23 30.67±1.10參菊洗劑中劑量組 0.324 19.86±1.12 21.24±0.77 22.69±1.05 24.15±0.94 24.58±1.11 27.14±1.24 28.61±1.07 30.24±0.94參菊洗劑高劑量組 0.540 19.92±0.87 21.37±1.10 22.80±1.14 24.19±1.33 25.51±1.04 27.29±0.88 28.87±1.24 30.54±1.01陰性對照組 – 20.02±1.03 21.50±1.25 22.91±1.13 24.26±0.98 25.69±0.94 27.38±1.05 28.99±1.25 30.75±1.17組別 含生藥量/g·mL-1

表5 參菊洗劑口服給藥急性毒性實驗對小鼠主要器官臟器指數的影響.±s，n=10Tab 5 Effect of acute oral toxicity test of Shenju lotion on organ index of mice.±s，n=10

表5 參菊洗劑口服給藥急性毒性實驗對小鼠主要器官臟器指數的影響.±s，n=10Tab 5 Effect of acute oral toxicity test of Shenju lotion on organ index of mice.±s，n=10

組別 含生藥量/g·mL-1 心 肝 脾 腎參菊洗劑低劑量組 0.108 0.62±0.25 4.96±0.31 0.35±0.21 0.89±0.23參菊洗劑中劑量組 0.324 0.60±0.18 5.02±0.43 0.36±0.19 0.90±0.19參菊洗劑高劑量組 0.540 0.61±0.22 4.92±0.39 0.34±0.16 0.90±0.35陰性對照組 – 0.62±0.20 5.11±0.48 0.33±0.17 0.92±0.26

4.3 參菊洗劑止癢作用機制

右旋糖酐是高分子葡萄糖聚合物，是多糖化合物中促組胺釋放作用最強的物質，注射后引起肥大細胞釋放組胺從而誘發炎性反應，使小鼠產生皮膚瘙癢[9]。引起瘙癢的物質基礎已經闡明，前列腺素E2，組胺，5-羥色胺，白細胞介素（IL）2、1、31等，都是瘙癢直接或間接的誘導因素，可誘發瘙癢的發生和發展[10]。

SOD是機體內重要的內源性抗氧化酶，能高效催化超氧化物自由基分解，抑制脂質過氧化，清除氧自由基，從而對抗氧化應激反應[11]，有效抵抗氧自由基對機體的傷害。SOD活力的高低，可間接反映出機體清除氧自由基的能力[12]。SOD不僅具有顯著的止癢作用，而且對抗組胺藥產生耐藥性的瘙癢也有顯著的治療作用[13]。大量的自由基引起脂質過氧化，MDA為多不飽和脂肪酸過氧化物的降解產物，測定MDA水平可反映機體內脂質過氧化及細胞受自由基攻擊的程度。TNF-α是由單核-巨噬細胞及T淋巴細胞產生的重要炎癥因子，TNF-α不僅介導炎癥反應，同時還可以誘導IL-1β、IL-6等炎癥因子的產生，參與全身或局部炎癥反應。SOD可下調TNF-α、IL-1、IL-2、IL-22、IL-31等炎癥因子的水平[14-15]，抑制炎癥因子的合成與釋放，對各種原因引起的瘙癢有直接或間接的作用。本研究通過測定右旋糖酐致炎小鼠血清的SOD、MDA、TNF-α等炎癥因子水平，探討了參菊洗劑的止癢作用機制，可能與抑制脂質過氧化及清除自由基、抑制炎癥因子的合成與釋放有關。