UPLC-MS/MS法測定人血漿中卡馬西平濃度

張 靜，袁宇琳，熊 雯（成都市食品藥品檢驗研究院，四川 成都 610000）

卡馬西平（carbamazepine，CBZ）為三環類抗癲癇藥物，是治療癲癇單純及復雜部分性發作的首選藥之一，在臨床上被廣泛應用。由于卡馬西平治療窗窄，個體差異大，在臨床上常需要進行治療藥物監測（therapeutic drug monitoring，TDM）以保證藥物治療的安全性和有效性[1]。為提高藥代動力學生物樣品檢測質量，衛生部臨床檢驗中心（以下簡稱臨檢中心）自2014年起，在全國范圍內開展藥代動力學檢驗室間質量評價活動（以下簡稱室間質評），評價項目為人血漿中CBZ的濃度測定[2]。本研究建立并驗證了超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）測定人血漿中CBZ濃度方法，本方法特異性好，精密度高，準確度好，使用該方法測定的室間質評樣品結果順利通過了考核，可供參與此項室間質評的相關實驗室參考。

1 資料與方法

1.1 試藥試劑

卡馬西平對照品（EDQM，批號：006539，含量：99.9%），卡馬西平-d8（carbamazepine-d8, CBZ-d8）對照品（加拿大TRC公司，批號：18-MVI-22-3，含量：96%），乙腈、甲酸為色譜純級，水為超純水，空白人血漿購自Bioreclamation IVT公司（抗凝劑為K2EDTA）。

1.2 儀器

LC-30A型超高效液相色譜儀（日本島津公司），Triple Quad 5500質譜儀（美國Applied Biosystems公司），XPE105型電子分析天平（法國METTLER TOLEDO公司），5810R型超速離心機（德國Eppendorf公司），VORTEX-T GENIE 2型旋渦混合器（美國SCIENTIFIC INDUSTRIES公司）。

1.3 色譜與質譜條件

色譜柱為Waters Xselsect?CSHTMC18柱（75 mm×2.1 mm，2.5 μm），流動相A為含0.05%甲酸的水溶液，流動相B為含0.05%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脫（0→0.8 min，A：95%→2%；0.8→2.0 min，A：2%；2.0→2.2 min，A：2%→95 %；2.2→3.1 min，A：95%），流速0.3 mL·min-1，柱溫40 ℃。

采用電噴霧離子源（ESI），多反應監測（MRM）正離子模式。離子源溫度500 ℃，離子噴霧電壓5500 V，輔助加熱氣壓力50 psi，霧化氣壓力50 psi，氣簾氣壓力35 psi，碰撞氣9 psi，去簇電壓10 V，碰撞電壓28 V。用于定量分析的離子對分別為：m/z237.1→194.1（CBZ），m/z245.0→202.1（CBZ-d8）。

1.4 標準品溶液和內標溶液的配制

精密稱取CBZ對照品10 mg，用乙腈溶解并定容至100 mL，得濃度為100 μg·mL-1的CBZ儲備液；取CBZ儲備液加水進行稀釋，配得所需濃度的系列CBZ標準工作液。

取CBZ-d8對照品1 mg（一個包裝），用乙腈溶解并定容至100 mL，得濃度為10 μg·mL-1的CBZ-d8儲備液；取CBZ-d8儲備液加水進行稀釋，配得CBZ-d8濃度為500 ng·mL-1的內標工作液。

1.5 血漿樣品的處理方法

取血漿樣品50 μL，加入10 μL內標工作液，旋渦混合15 s后，再加入340 μL乙腈，旋渦混合30 s后，于12 000 g、4 ℃離心10 min，吸取上清液20 μL，再加入0.05%甲酸水溶液380 μL稀釋，旋渦混合15 s，取100 μL至進樣瓶中，進樣2 μL。

2 結果

2.1 方法的選擇性

在本實驗條件下，考察了6個來源的血漿，結果顯示6個來源的血漿在CBZ和內標出峰處均無內源性物質干擾，CBZ及內標峰形良好，保留時間均為1.70 min。表明該方法選擇性良好，內源性物質不干擾測定。

2.2 標準曲線及定量下限

用空白血漿加CBZ標準工作液，分別配制得到濃度為5、10、20、50、100、300、800、1000 ng·mL-1的血漿標準曲線樣品，按“1.5”項下進行處理，進樣分析。以CBZ濃度為橫坐標（x），CBZ與內標峰面積的比值為縱坐標（y），采用加權（1/x2）最小二乘法進行線性回歸，CBZ連續3天的標準曲線回歸方程見表1。結果表明，CBZ在5～1000 ng·mL-1濃度范圍內線性關系良好，線性相關系數（r）范圍為0.999 3～0.999 9。

配制定量下限濃度的血漿樣品6份，按“1.5”項下進行處理，進樣分析，連續測定3 d。批內精密度為2.66%～4.10%，批內準確度為101.05%～106.33%，批間精密度為3.71%，批間準確度為103.38%。

表1 線性回歸方程Tab 1 Linear regression equation

2.3 殘留

在標準曲線最高濃度（1000 ng·mL-1）血漿樣品進樣后，再進樣空白樣品以評價殘留效應。測定結果為卡馬西平的峰面積低于定量下限的20%，內標峰面積低于樣品的5%，表明該方法殘留效應小，殘留對分析無影響。

2.4 準確度和精密度

配制4個濃度（15、50、500、750 ng·mL-1）的質控血漿樣品各6份，按“1.5”項下進行處理，進樣分析，連續測定3 d，計算批內、批間準確度和精密度見表2。結果表明，該方法批內和批間準確度和精密度良好。

表2 批內、批間精密度和準確度.n=6Tab 2 Intra-day and inter-day precisions and accuracies.n=6

2.5 基質效應

取6個不同來源的血漿，按“1.5”項下進行處理獲得空白上清液，分別加入標準品溶液配制4個濃度（15、50、500、750 ng·mL-1）的血漿樣品各3份，進樣分析，記錄峰面積為AM。用水代替血漿加入標準品溶液配得相應的溶液樣品，進樣分析，記錄峰面積為AW。基質效應=AM/AW×100 %，內標歸一化基質效應=CBZ基質效應/內標基質效應×100%。結果見表3，6種不同來源的血漿CBZ和內標基質效應均較小，表明該方法基質效應小，血漿基質不干擾測定。

2.6 回收率

配制4個濃度（15、50、500、750 ng·mL-1）的質控血漿樣品各6份，按“1.5”項下進行處理，進樣分析，記錄峰面積為AE。取空白血漿按“1.5”項下處理獲得空白上清液，分別加入標準品溶液配制相應濃度的的血漿樣品各6份，進樣分析，記錄峰面積為AS。回收率=AE/AS×100%。結果顯示，CBZ濃度為15、50、500、750 ng·mL-1時，回收率依次為97.77%、102.02%、98.74%、100.89%，內標（500 ng·mL-1）回收率為99.13%，表明該方法回收率良好。

2.7 稀釋驗證

配制濃度為1500 ng·mL-1的血漿樣品各6份，用空白血漿稀釋2倍得到濃度為750 ng·mL-1的質控血漿樣品，按“1.5”項下進行處理，進樣分析。稀釋2倍的血漿樣品與理論值的準確度偏差為–1.33%，RSD為2.22%，表明樣品稀釋2倍測定不影響該方法的精密度與準確度。

2.8 穩定性和進樣重復性實驗

配制濃度為15、750 ng·mL-1的質控血漿樣品各6份，分別考察血漿樣品2次凍融（–80 ℃冷凍，取出后室溫解凍，重復2次）、室溫放置（日光，6 h）、進樣室放置（10 ℃，11 h）穩定性和自動進樣器進樣3次重復性。將處理后樣品的測定結果與理論濃度進行比較，結果見表4。結果表明，血漿樣品反復凍融2次、室溫放置6 h和進樣室放置11 h均穩定，自動進樣器進樣重復性良好。

表3 CBZ和內標的基質效應.±s，n=3Tab 3 Matrix effects of carbamazepine and internal standard.±s，n=3

表3 CBZ和內標的基質效應.±s，n=3Tab 3 Matrix effects of carbamazepine and internal standard.±s，n=3

基質編號內標基質效應/%01 104.47±1.62 101.19±1.68 102.45±1.31 101.76±0.73 103.22±0.13 099.87±0.25 107.12±2.10 106.42±1.01 103.23±0.53 02 103.66±0.68 100.37±0.59 102.74±0.22 102.80±1.32 104.93±0.93 100.67±0.20 109.18±1.98 107.43±3.16 103.26±0.67 03 103.01±1.46 100.62±0.68 102.29±0.46 102.81±0.74 103.07±0.70 101.08±0.20 107.32±2.45 106.59±2.55 102.37±1.55 04 100.96±1.45 100.07±1.40 100.36±0.70 101.65±0.68 102.95±0.41 101.47±0.58 106.46±1.94 107.60±1.28 100.88±0.06 05 100.93±0.90 099.83±0.78 099.08±0.78 101.77±0.69 101.10±1.70 100.80±0.73 102.09±2.83 104.05±1.17 101.10±0.75 06 100.69±0.98 100.76±0.28 099.43±0.56 102.61±0.49 100.09±0.41 100.26±0.25 103.88±1.52 106.76±1.63 099.93±1.03 750 ng·mL-1 500 ng·mL-1 75 ng·mL-1 15 ng·mL-1 500 ng·mL-1 CBZ基質效應/%CBZ內標歸一化基質效應因子/%CBZ基質效應/%CBZ內標歸一化基質效應因子/%CBZ基質效應/%CBZ內標歸一化基質效應因子/%CBZ基質效應/%CBZ內標歸一化基質效應因子/%

表4 樣品穩定性和進樣重復性結果.±s，n=6Tab 4 Results of sample stability and injection reproducibility.±s，n=6

表4 樣品穩定性和進樣重復性結果.±s，n=6Tab 4 Results of sample stability and injection reproducibility.±s，n=6

理論濃度/ng·mL-1凍融2次 室溫放置6 h 進樣室放置11 h 重復進樣3次準確度/% CV/% 準確度/% CV/% 準確度/% CV/% 準確度/% CV/%15 096.4±2.21 2.30 097.49±1.30 1.33 96.06±3.17 3.30 94.45±3.42 3.62 750 102.49±0.59 0.58 101.28±1.82 1.80 99.99±1.12 1.12 99.99±0.64 0.64

2.9 質控樣品測定

按“1.5”項下處理臨檢中心送檢的5個未知濃度CBZ血漿樣品，進樣分析，具體結果見表5。質評結果表明，所有質評樣品測定結果均在允許范圍內。

表5 室間質評中5個樣品的測定結果Tab 5 Results of 5 samples in external quality assessment

3 討論

3.1 現狀

目前，文獻報道的卡馬西平血藥濃度測定方法主要有免疫分析法[3]、高效液相色譜-紫外（HPLC-UV）法[4-5]、高效液相色譜-二極管陣列（HPLC-DAD）法[6]和液質聯用法[7]。

其中，免疫分析法操作簡便快速、自動化程度高，適用于臨床急癥的快速分析；但選擇性不佳，代謝物易干擾藥物濃度的測定，且依賴于進口試劑盒，分析成本較高。HPLC-UV法和HPLC-DAD法選擇性強、靈敏度高，但分析物和干擾物質必須達到色譜分離才能準確定量，方法開發時對預處理和色譜條件要求較高，且靈敏度低于液質聯用法；謝燕如等[8]報道的反相高效液相色譜法測定人血漿中卡馬西平濃度，其定量下限為1000 ng·mL-1，單個樣品分析時間為7 min。液質聯用法較HPLC法分析時間更短，選擇性更好，靈敏度更高，孫曉清等[9]報道的UPLC-MS/MS法同時檢測人血漿中卡馬西平和苯巴比妥濃度，卡馬西平定量下限可達10 ng·mL-1，單個樣品分析時間為3 min。本研究確定的液-質聯用法定量下限為5 ng·mL-1，單個樣品分析時間為3.1 min，操作簡便快速、專屬性好、靈敏度高，適用于低濃度樣品的快速測定。

3.2 條件優化

本研究在選擇流動相時，考察了不同水相：0%、0.05%、0.10%、0.20%濃度的甲酸水溶液，不同有機相：甲醇、乙腈以及含不同濃度甲酸的甲醇、乙腈溶液，最終確定水相為含0.05%甲酸的水溶液，有機相為含0.05%甲酸的乙腈溶液進行梯度洗脫，分析時間為3.1 min，色譜峰形良好，無內源性物質干擾，分析時間短。在開發樣品預處理方法時，考察了不同沉淀劑及體積，顯示乙腈沉淀效果優于甲醇，優化得到的乙腈加入體積既保證沉淀效果也保證待測物響應。沉淀后上清液中加入0.05%甲酸水溶液作為稀釋液，可以降低生物基質對質譜檢測器的干擾，同時水相的加入大大改善了色譜峰形。本研究采用CBZ-d8為內標，內標與待測物結構及理化性質相似，在處理過程中提取率一致、質譜響應相似，使得該方法重現性良好，批內和批間精密度和準確度良好，回收率高，基質效應低。

3.3 室間質評結果分析

通過建立的方法測定5個質評樣品全部通過，且與靶值偏差小于4.5%，表明該方法結果準確可靠。分析質評結果可知，實測值較理論值存在正偏差，提示該方法可能存在一定的系統誤差，也可能為質評樣品在運輸和存放過程水分減少樣品濃縮導致。同時，質評結果還顯示高濃度樣品的偏差較低濃度更大，可能是由于線性擬合時采用加權（1/x2）最小二乘法，使得擬合方程時更偏重于低濃度導致。

綜上，本研究建立并驗證了UPLC-MS/MS法測定人血漿中CBZ濃度，該方法簡單快速、靈敏度高、特異性好、重現性好，符合臨檢中心關于藥代動力學實驗室生物樣品檢測的要求，尤其適用于低濃度血漿樣品的快速分析，可應用于室間質評、TDM及人體生物藥代動力學樣品測定。