C/EBPβ通過(guò)調(diào)控MYCT1表達(dá)影響肝癌細(xì)胞遷移

梁雪亭，馮博

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放射科介入病房，沈陽(yáng) 110001）

肝癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，具有病情進(jìn)展快、惡性程度高、多發(fā)轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，在中國(guó)乃至世界一直保持著較高的發(fā)病率與死亡率。據(jù)文獻(xiàn)［1］報(bào)道，2015年中國(guó)肝癌的發(fā)病率及死亡率分別排在所有腫瘤中的第四名和第三名。盡管針對(duì)肝癌有多種治療手段，但由于肝癌致病因素復(fù)雜，發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚不明確，仍然缺少有效的靶向治療方式。

Myc target 1（MYCT1），也稱MTLC，是最早在喉鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)的一種與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因［2］。研究［3-4］表明，MYCT1參與調(diào)控肝癌組織中mRNA表達(dá)，且其中1個(gè)轉(zhuǎn)錄本MYCT1-TV參與調(diào)控Bel7402細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲能力。有多種轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控MYCT1基因，從而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展。喉癌中，YY1直接抑制MYCT1基因表達(dá)，并抑制其在hep2細(xì)胞系中的抑癌作用［5］。同樣，CREB可抑制喉癌中MYCT1基因的表達(dá)，并通過(guò)MYCT1/NAT10通路促進(jìn)細(xì)胞遷移能力［6］。

CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β（CCAAT/enhancer binding protein β，C/EBPβ）是轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（CCAAT/enhancer binding proteins，C/EBPs）家族的重要成員，在炎癥調(diào)控、細(xì)胞增殖、分化以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等方面都起著重要的作用［7-9］。此外，C/EBPβ還可作為乙型肝炎病毒宿主因子，參與病毒復(fù)制和肝癌癌前病變過(guò)程［10］。然而，C/EBPβ在肝癌中的具體調(diào)控機(jī)制目前仍不清楚。本研究組通過(guò)Jasper等預(yù)測(cè)軟件發(fā)現(xiàn)，MYCT1是C/EBPβ的靶基因之一。本研究擬探討在肝癌SMMC7721細(xì)胞中敲減C/EBPβ對(duì)MYCT1表達(dá)的調(diào)控作用，以及MYCT1對(duì)細(xì)胞遷移功能的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系SMMC7721購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，在含有10%胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）及雙抗的1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，1～2 d更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后，用0.25%胰酶消化后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2 基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

細(xì)胞轉(zhuǎn)染前24 h接種至6孔板（2×105～3×105/mL）。待細(xì)胞成長(zhǎng)至密度約為70%～80%時(shí)，采用jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑（法國(guó)Polyplus transfection公司）進(jìn)行siRNAs（siMYCT1，siC/EBPβ）（上海生工公司）及各自對(duì)照組轉(zhuǎn)染。6～8 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)基，進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，或繼續(xù)培養(yǎng)48 h提取RNA和蛋白進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

轉(zhuǎn)染siRNA序列如下：siMYCT1，5'-GCUGUGA ACGUCGAAGCAATT-3'；siC/EBPβ，5'-CCCACGUG UAACUGUCAGCTT-3'。

1.3 實(shí)時(shí)qPCR檢測(cè)

收集轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞，用RNA提取劑TRIzol（日本TaKaRa公司）提取總RNA，應(yīng)用TaKaRa PrimeScript RT Master Mix Kit（Perfect Real Time）（日本TaKaRa公司）試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)成cDNA。應(yīng)用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（日本TaKaRa公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)qPCR檢測(cè)。PCR體系及條件均依照說(shuō)明書(shū)，以2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參。

實(shí)驗(yàn)所需引物序列如下：MYCT1F 5'-ATGGCA ATCGGGCTGGTA-3'，R 5'-CTTGTCGCTGGAAGGT GA -3'；C/EBPβF 5'-CACAGCGACGACTGCAAGAT CC-3'，R 5'-CTTGAACAAGTTCCGCAGGGTG-3'；GAPDHF 5'-CATGTTCGTCATGGGTGTGAACC -3'，R 5'-GGTCATGAGTCCTTCCACGATACC -3'。

1.4 Western blotting

收集轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞，在含有PMSF（上海華舜公司）的RIPA裂解液（上海碧云天公司）中裂解細(xì)胞，并通過(guò)BCA蛋白測(cè)定試劑盒（上海碧云天公司）測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品在12% SDS-PAGE上分離，通過(guò)濕轉(zhuǎn)膜方式轉(zhuǎn)移至PVDF膜（美國(guó)Millipore公司）。5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入兔源MYCT1抗體（1︰300稀釋，英國(guó)Abcam公司）或小鼠源GAPDH抗體（1︰2 000稀釋，中國(guó)Proteintech公司），4 ℃封閉過(guò)夜。次日，洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/鼠二抗（1︰3 000稀釋，中國(guó)Proteintech公司），37 ℃孵育1 h。TBST洗膜后，ECL（中國(guó)天根公司）發(fā)光，在暗室中通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)進(jìn)行曝光取圖。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

在6孔板中培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染細(xì)胞，6 h后在每孔中心用1 mL移液器槍頭水平劃痕，更換培養(yǎng)液，并于顯微鏡下拍照，記錄劃痕寬度。于24 h、48 h后分別更換培養(yǎng)液，并拍照，記錄劃痕寬度。匯總圖片中劃痕寬度，分析細(xì)胞遷移能力。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)

在6孔板中培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染細(xì)胞，6 h后胰酶消化，使用雙無(wú)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，分別向Transwell小室上室加入100 μL細(xì)胞懸液（5×105/mL），下室加入500 μL含10%血清的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱孵育。24 h后取出小室，4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min，PBS沖洗小室上層，并用棉簽擦拭小室上層細(xì)胞。用小刀剝下小室薄膜，薄膜下層朝上，中性樹(shù)脂封片。干燥后，于顯微鏡下拍照取圖分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0軟件，進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以表示。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌細(xì)胞中C/EBPβ對(duì)MYCT1的表達(dá)調(diào)控

通過(guò)實(shí)時(shí)qPCR檢測(cè)SMMC7721細(xì)胞中siC/EBPβ和siMYCT1的轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示，siMYCT1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中MYCT1mRNA水平較對(duì)照組顯著降低（圖1A，P＜ 0.05），siC/EBPβ轉(zhuǎn)染組C/EBPβmRNA水 平較對(duì)照組顯著降低（圖1B，P＜ 0.05）。同時(shí)，通過(guò)在SMMC7721細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siC/EBPβ檢 測(cè)C/EBPβ對(duì)MYCT1mRNA、蛋白水平的調(diào)控作用。實(shí)時(shí)qPCR結(jié)果顯示敲減C/EBPβ組MYCT1mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著提高（圖1C，P＜ 0.05）；Western blotting結(jié)果顯示，敲減C/EBPβ組MYCT1基因蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著提高（圖1D，P＜ 0.05）。以上結(jié)果提示，敲減C/EBPβ可顯著提高M(jìn)YCT1基因的表達(dá)。

2.2 C/EBPβ通過(guò)調(diào)控MYCT1的表達(dá)影響肝癌細(xì)胞遷移能力

圖1 SMMC7721細(xì)胞siC/EBPβ、siMYCT1轉(zhuǎn)染效率及siC/EBPβ對(duì)MYCT1基因表達(dá)的影響Fig.1 Transfection efficiency of siC/EBPβ and siMYCT1 in SMMC7721 cells and effect of siC/EBPβ on MYCT1 gene expression

通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)染后的SMMC7721細(xì)胞進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)敲減C/EBPβ對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示，在劃痕形成的24 h以及48 h內(nèi)，與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染siC/EBPβ的細(xì)胞遷移的距離顯著減少，轉(zhuǎn)染siMYCT1的細(xì)胞遷移的距離顯著增多，共轉(zhuǎn)染siC/EBPβ與siMYCT1可顯著恢復(fù)siMYCT1對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響（P＜ 0.05），見(jiàn)圖2。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染siC/EBPβ細(xì)胞穿過(guò)薄膜的數(shù)量顯著減少，轉(zhuǎn)染siMYCT1細(xì)胞穿過(guò)薄膜的數(shù)量顯著增多，共轉(zhuǎn)染siC/EBPβ與siMYCT1則可顯著恢復(fù)siMYCT1對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響（P＜ 0.05）。見(jiàn)圖3。

圖2 遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)C/EBPβ對(duì)SMMC7721細(xì)胞遷移能力的影響Fig.2 The effect of C/EBPβ on SMMC7721 cell migration in a scratch assay

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)C/EBPβ對(duì)SMMC7721細(xì)胞遷移能力的影響Fig.3 The effect of C/EBPβ on SMMC7721 cell migration in Transwell assay

3 討論

自從在喉鱗狀細(xì)胞癌中首次發(fā)現(xiàn)MYCT1基因后，MYCT1基因在其他癌癥和疾病中的作用受到越來(lái)越多的關(guān)注。MYCT1基因在胃癌組織中下調(diào)并誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡［11］。最近，MYCT1基因過(guò)表達(dá)被證實(shí)可抑制急性髓系白血病細(xì)胞的增殖能力，并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡［12］。同時(shí)，高表達(dá)MYCT1的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記可用來(lái)表征evi1重組的急性髓系白血病，為白血病的治療提供了新的思路。而在肝癌中的MYCT1相關(guān)研究較少見(jiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，敲減MYCT1可顯著提高肝癌SMMC7721細(xì)胞的遷移能力，與早期研究［2-3］結(jié)果趨勢(shì)一致。

C/EBPβ作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究［13-14］表明，C/EBPβ可通過(guò)上調(diào)肝癌中血清類黏蛋白2的表達(dá)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，并與COX-2共表達(dá)，參與二乙基亞硝酸鈉誘導(dǎo)的肝癌的發(fā)生。此外，C/EBPβ還可通過(guò)表觀遺傳的方式參與肝癌的進(jìn)程，在肝癌早期發(fā)展過(guò)程中，C/EBPβ的低甲基化與致癌作用激活相關(guān)［15］。本研究中檢測(cè)了肝癌細(xì)胞中C/EBPβ對(duì)MYCT1基因的調(diào)控作用，證實(shí)了敲減C/EBPβ可顯著提高M(jìn)YCT1基因的表達(dá)，從而影響肝癌SMMC7721細(xì)胞的遷移能力。然而，C/EBPβ調(diào)控MYCT1的具體機(jī)制尚不清楚，C/EBPβ是否是通過(guò)直接靶向結(jié)合MYCT1從而影響其生物學(xué)功能，仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，敲減MYCT1可顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的遷移能力，而敲減C/EBPβ可顯著上調(diào)MYCT1基因的表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞的遷移。但C/EBPβ調(diào)控MYCT1基因表達(dá)及其影響遷移功能的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果提示，C/EBPβ可能是MYCT1基因的一個(gè)潛在轉(zhuǎn)錄因子，為今后肝癌分子機(jī)制研究及靶向治療提供了新的思路。