毒胡蘿卜素抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲并誘導細胞凋亡

沈帆，王麗麗，趙楊

（中國醫科大學附屬第一醫院婦科，沈陽 110001）

卵巢上皮癌的死亡率居婦科腫瘤的首位［1］。由于臨床癥狀不典型，缺乏有效的篩查手段，導致大多數患者就診時已近晚期。卵巢上皮癌術后易復發、轉移，導致預后較差［2-3］，晚期患者平均5年存活率僅約30%［4］。因此，亟需尋找治療卵巢上皮癌的有效藥物。

肌漿/內質網Ca2+-ATP酶（sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ATPase，SERCA）是一種位于肌漿/內質網膜上的細胞內Ca2+泵。SERCA介導Ca2+從細胞質向肌漿/內質網轉運，是維持細胞內Ca2+穩態的關鍵［5］。有研究［6］表明，脂肪肉瘤中SERCA2過表達能夠激活細胞存活途徑。SERCA2在結直腸癌細胞中的過度表達驅動增殖和遷移，在結直腸癌發生中起關鍵作用［7］。卵巢癌細胞中SERCA2表達水平高于正常卵巢表面上皮細胞［8］，提示SERCA2可能促進卵巢癌的發生發展。研究［9-10］表明，抑制SERCA表達導致內質網鈣儲存池的耗盡，并使細胞內Ca2+水平升高，可能導致內質網和線粒體受損，從而導致細胞凋亡。毒胡蘿卜素是SERCA2的特異性不可逆抑制劑，通過干擾內質網內Ca2+穩態誘導癌細胞凋亡［11］。本研究擬探討毒胡蘿卜素在卵巢癌細胞中的作用及其潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養及處理

本研究采用人卵巢癌細胞系OVCAR3和A2780。OVCAR3細胞在RPMI 1640培養基（美國HyClone公司）中培養，A2780細胞在DMEM培養基（美國HyClone公司）中培養。培養基中添加1%青霉素/鏈霉素和10%胎牛血清。細胞在5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中孵育。以毒胡蘿卜素濃度0.031 25～1.0 μmol/L（OVCAR3）和0.062 5～2.0 μmol/L（A2780）進行細胞活力測定，篩選出最佳作用濃度（OVCAR3：0.062 5 μmol/L，A2780：0.25 μmol/L）進行后續實驗，以加入DMSO為對照組。

1.2 細胞活力測定（MTT法）

收集并計數細胞，接種在96孔板中（3 000細胞/孔）。培養至細胞單層鋪滿孔底，加入不同濃度梯度的毒胡蘿卜素，同時設置對照孔。在處理后0、24、48和72 h，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），孵箱中培養4 h。棄培養液，加入DMSO溶液150 μL/孔。用微孔板分光光度計（美國Bio-Tek Instruments公司）檢測各孔在波長490 nm處的吸光度，計算半數抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC50）。

1.3 細胞凋亡檢測

用不含EDTA的胰蛋白酶消化細胞后，以1 500 r/min離心5 min，用冷PBS洗滌，以同樣速度再次離心。棄PBS，加入1×binding緩沖液100 μL制作細胞懸液，在避光條件下，分別加入5 μL碘化丙錠（propidium iodide，PI）和5 μL 膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（美國BD Biosciences公司），輕輕混勻并室溫孵育30 min，加入1×binding緩沖液400 μL，通過流式細胞術測定細胞的凋亡率。

1.4 Ca2+濃度測定

收集細胞并離心，PBS洗滌2次。用無胎牛血清培養基重懸細胞后，加入Fluo-3-AM（美國Biotium公司，終濃度5 μmol/L）。避光條件下，37 ℃孵育細胞30 min。離心并去除多余染料，PBS反復洗滌、離心3次。加入500 μL PBS重懸細胞后，進行流式細胞儀上機檢測。

1.5 細胞劃痕實驗

將細胞接種于6孔板中，37 ℃培養至80%融合。用200 μL微量加樣器槍頭垂直于6孔板劃痕，用PBS洗除劃痕產生的細胞碎片后，在無胎牛血清培養基中培養細胞。在劃痕后0和48 h時顯微鏡下拍照。使用ImageJ軟 件（美 國National Institutes of Health）測量劃痕區域的面積。計算細胞遷移率=（原劃痕面積-不同時間點的劃痕面積）/原劃痕面積×100%。

1.6 細胞侵襲實驗

用無血清培養基1 ∶10稀釋4 ℃放置過夜的基質膠（美國Sigma-Aldrich公司），并以30 μL/孔加入Transwell小室，置于培養箱孵育4 h。將重懸于200 μL無血清培養基中的細胞接種于Transwell上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養基作為趨化劑。37 ℃下孵育48 h，擦去上表面未穿透基質膠的細胞，PBS洗2遍。4%多聚甲醛固定15 min，行結晶紫染色，用PBS洗去染料。常溫下晾干封片，倒置熒光顯微鏡（CKX53，日本Olympus公司）下拍照。

1.7 實時熒光定量PCR

使用TRIzol試劑（日本TaKaRa公司）提取卵巢癌細胞總RNA。使用分光光度計（中國上海Unico公司）檢測OD260nm/280nm，計算RNA濃度。按照Promega逆轉錄試劑盒說明書，將RNA逆轉錄成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒（日本TaKaRa公司）擴增cDNA。每個靶基因的表達水平以18S mRNA為內參對照。各基因引物序列如下：SERCA2，5'-GGTGGCAACAGA ACAGG-3'，5'-CCAGGCAGGTGGTGAT-3'；CCAAT增強子結合同源蛋白（C/EBP-homologous protein，CHOP）基 因，5'-ACTCTTGACCCTGCTTCTC-3'，5'-A GTCGCCTCTACTTCCCT-3'；血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）基因，5'-TGGGACAGTAGAAAGGG-3'，5'-AAGGGAGTGG TAGCAGTA-3'；B細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma 2，BCL2）基因，5'-TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3'，5'-CTACCCAGCCTCCGTTATCC-3'；SURVIVIN，5'-CT TGGCCCAGTGTTTCTT-3'，5'-GCTTCCAGTCCCTCC CT-3'；B細胞淋巴瘤XL（B-cell lymphoma-XL，BCL-XL）基因，5'-TTCCCAGAAAGGATACAGC-3'，5'-GG GTCTCCATCTCCGATT-3'；18S，5'-GAAACGGCTACC ACATCC-3'，5'-ACCAGACTTGCCCTCCA-3'。根 據來自3個獨立實驗的樣品閾值循環（Ct）分析數據。

1.8 Western blotting

使用細胞裂解液處理經毒胡蘿卜素處理的卵巢癌細胞，蛋白定量。行SDS-PAGE電泳，轉移至纖維素膜（德國Amersham公司）。用3%牛血清白蛋白在室溫下封閉1.5 h，孵育一抗SERCA2、CHOP、VEGFA、BCL-2、SURVIVIN、BCL-XL（1 ∶1 000稀釋，美國Proteintech公司），4 ℃孵育過夜，抗β-actin（1 ∶2 000稀釋，美國Proteintech公司）作為內參。次日用1×TBST洗膜3次，用山羊抗兔二抗（1 ∶5 000稀釋，中國Abbkine公司）在室溫下孵育2 h，用1×TBST洗膜3次。用增強型化學發光試劑（美國Santa Cruz Biotechnology公司）曝光成像。

圖1 Thapsigargin抑制卵巢細胞的增殖Fig.1 Thapsigargin inhibits proliferation of ovarian cancer cells

1.9 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。2組計量資料采用Student'st檢驗進行比較。所有P值均為雙側，且P＜ 0.05為差異有統計學意義。每組實驗至少重復3次。

2 結果

2.1 毒胡蘿卜素抑制卵巢癌細胞的增殖

MTT結果顯示，卵巢癌OVCAR3和A2780細胞分別暴露于濃度為0.031 25～1.0 μmol/L和0.062 5～2.0 μmol/L的毒胡蘿卜素后，與對照組相比，卵巢癌OVCAR3和A2780細胞的增殖能力下降，并呈劑量依賴性（P＜ 0.05），見圖1。

毒胡蘿卜素對OVCAR3的IC50為0.270 3 μmol/L，對A2780的IC50為0.899 4 μmol/L。在保證細胞活力的前提下，選取毒胡蘿卜素濃度分別為0.062 5 μmol/L和0.25 μmol/L對應卵巢癌細胞系OVCAR3和A2780進行后續實驗。

2.2 毒胡蘿卜素可增加細胞質中Ca2+濃度并誘導卵巢癌細胞凋亡

流式細胞術分析結果顯示，毒胡蘿卜素能夠增加卵巢癌細胞胞質中的Ca2+濃度（P＜ 0.05，圖2A），并能顯著誘導卵巢癌細胞系OVCAR3和A2780的凋亡（P＜ 0.05，圖2B）。

2.3 毒胡蘿卜素處理后卵巢癌細胞遷移和侵襲能力下降

進一步評估毒胡蘿卜素處理后卵巢癌細胞的遷移和侵襲能力的變化，結果表明，毒胡蘿卜素能夠顯著降低卵巢癌細胞系OVCAR3和A2780的遷移和侵襲能力（P＜ 0.05，圖3、圖4）。

2.4 毒胡蘿卜素作用下卵巢癌細胞中相關基因mRNA和蛋白表達的變化

經毒胡蘿卜素處理后，SERCA2、VEGFA、BCL-2、BCL-XL和SURVIVINmRNA和蛋白表達水平均下降，而CHOP的表達則增加（P＜ 0.05，圖5）。

3 討論

SERCA抑制劑毒胡蘿卜素是一種潛在的抑癌劑［12］。研究［13］表明，毒胡蘿卜素與洋地黃毒苷對ER陰性乳腺癌細胞具有協同抑制作用。在前列腺癌中，毒胡蘿卜素可通過激活凋亡途徑誘導癌細胞死亡［14］。此外，毒胡蘿卜素還可通過破壞人肺癌細胞的細胞骨架誘導細胞凋亡［15］。

圖3 毒胡蘿卜素處理后細胞遷移能力下降 ×40Fig.3 Thapsigargin reduces cell migration capacity ×40

本研究結果顯示，不同濃度的毒胡蘿卜素能夠降低卵巢癌細胞系OVCAR3和A2780的細胞活力，且呈劑量依賴性。同時，卵巢癌細胞系OVCAR3和A2780的增殖在毒胡蘿卜素濃度分別為0.062 5μmol/L和0.25 μmol/L時受到顯著抑制，因此，分別選取這2個濃度對應卵巢癌細胞系OVCAR3和A2780進行后續實驗。毒胡蘿卜素處理后，2種細胞的活力均降低，凋亡細胞的比例增加，遷移和侵襲能力下降。表明毒胡蘿卜素可抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲，增加卵巢癌細胞的凋亡。

圖4 毒胡蘿卜素處理后細胞侵襲能力下降 ×100Fig.4 Thapsigargin reduces cell invasive capacity ×100

圖5 毒胡蘿卜素作用下卵巢癌細胞中相關蛋白質表達的變化Fig.5 Changes of related protein expression in ovarian cancer cells induced by thapsigargin

鈣調節泵SERCA在維持細胞內Ca2+穩態中起關鍵作用，它能夠主動將釋放的Ca2+重新積聚回肌漿內質網，從而維持Ca2+穩態。細胞內Ca2+在控制細胞生長、分化和凋亡的多種信號通路中起關鍵作用［16］。胰腺癌中，Ca2+/鈣調神經磷酸酶/NFAT信號通路參與癌基因c-Myc的上調轉錄機制，導致G1/S期轉變加速，最終促進胰腺癌細胞的增殖［17］。在某些乳腺癌中，存在特定鈣可滲透離子通道的表達變化，這種變化可能在乳腺癌細胞的增殖和侵襲性中起重要作用，甚至與乳腺癌亞型及預后有關［18］。研究［19］表明，SERCA失調引起內質網鈣儲存池Ca2+的枯竭，進而導致細胞內鈣水平上升。高胞質水平的Ca2+能夠引起內質網應激反應，導致未折疊蛋白積累，啟動細胞凋亡途徑［20］。研究發現，SERCA2在多種腫瘤中發揮促癌作用。本研究結果顯示，經毒胡蘿卜素處理后，卵巢癌細胞中SERCA2、BCL2、BCLXL和SURVIVINmRNA和蛋白表達水平均降低，細胞質中Ca2+濃度增加。提示毒胡蘿卜素可有效抑制SERCA2的表達，促使Ca2+水平升高，降低抗凋亡蛋白BCL2及BCL-XL表達水平，進而引起卵巢癌細胞中的內質網應激和細胞凋亡。

本研究還發現，用毒胡蘿卜素處理卵巢癌細胞后，CHOPmRNA及蛋白表達水平升高。CHOP也稱為生長停滯和DNA損傷誘導基因153（growth arrest and DNA damage gene 153，GADD153），是內質網應激反應的特定轉錄因子，在正常條件下呈低表達水平，其上調能夠誘導細胞生長停滯和凋亡［21-22］。在胰腺癌細胞中，特異性siRNA誘導的CHOP表達下調顯著降低了辣椒素誘導的細胞凋亡［23］。因此，毒胡蘿卜素可能通過激活CHOP誘導卵巢癌細胞凋亡。

VEGFA主要與2種酪氨酸激酶受體VEGFR1（Flt-1）和VEGFR2（KDR/Flk-1）結合，從而調節內皮細胞增殖、遷移和血管通透性，促進腫瘤血管生成［24］。本研究發現，毒胡蘿卜素可降低卵巢癌細胞VEGFA表達水平，抑制卵巢癌細胞的侵襲轉移能力，提示毒胡蘿卜素可能通過VEGFA抑制卵巢癌細胞的侵襲和轉移。

綜上所述，本研究結果表明，毒胡蘿卜素能夠抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移及侵襲轉移能力，并且可能通過調節SERCA2誘導卵巢癌細胞凋亡。