兩種檢測血型抗體IgG亞型的方法比較

馬印圖, 陳 莉, 張 怡, 董書文, 王振雷, 楊曉亞, 王少文, 李莉華

(1.河北省石家莊市聯勤保障部隊第九八〇醫院輸血科，河北 石家莊 050082 2.河北省血液中心，河北 石家莊 050071)

新生兒溶血病(hemolytic disease of the newborn，HDN)是由于胎兒與其母親之間血型不相同，胎兒的少量紅細胞經過胎盤出血進入母親體內，刺激孕婦產生了針對胎兒紅細胞的血型特異性抗體，這些抗體進而破壞胎兒的紅細胞，引起胎兒和/或新生兒發生免疫性溶血反應，嚴重者可引起死胎或高膽紅素腦病的嚴重后果。新生兒溶血的輕重與多種因素有關，其中與血型抗體IgG亞型有直接關系。由于檢測方法的差異新生兒高膽紅素血癥的發生率在30～60%之間[1]。文獻報道孕母血液中IgG1和IgG3亞型的含量與新生兒是否發病密切相關[2]。我們研究建立了微柱凝膠技術檢測血型抗體IgG亞型的試驗方法，與目前臨床常用的ELISA方法進行平行試驗，對孕婦及其產后新生兒血液標本進行了IgG亞型分析，評價兩種方法檢測IgG亞型與新生兒溶血病的相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 病例資料:2018年1月至2018年12月在我院產科檢查的血型抗體高效價孕婦62例，其中孕婦血型為O型，Rh陽性，丈夫血型為A、B或AB型57例，免疫性抗A(B)效價≥512；Rh(D)陰性孕婦5例，抗D效價≥64，孕婦年齡22～41歲，平均(29.5±0.5)歲，無輸血史及藥物過敏史，非近親結婚，產后有27例新生兒經溶血三項試驗檢測確診和可疑HDN的血液標本也同步進行了IgG亞型檢測，對比觀察兩種方法檢測IgG亞型的一致性，分析血型抗體效價以及IgG各亞型與新生兒溶血病的相關性。

1.2 方 法

1.2.1 血型單抗試劑、0.2mol/L 2-巰基乙醇液(2-Me)、試劑紅細胞由上海血液生物醫藥公司提供, liss/Coombs微柱凝膠卡、專用離心機、恒溫孵育器由瑞士達亞美公司生產,IgG亞型微柱凝膠檢測卡、專用離心機、孵育器由江蘇力博醫藥生物技術股份有限公司提供，ELISA法IgG亞型檢測試劑盒(美國Sigma公司提供)。

1.2.2 血型鑒定、抗體效價測定和新生兒溶血三項試驗(直接抗球蛋白試驗、游離抗體試驗、抗體釋放試驗)操作和結果判定均嚴格按照文獻進行[3,4]，對可疑和確診為與血型有關的HDN及時通知患兒的主治醫師。

1.2.3 IgG亞型檢測:MGTA試驗方法和步驟按照文獻進行[5]。采集O型孕婦4mL外周血,分離后取血清200ul與等量2-Me于試管中混合，37℃處理30min破壞血清中的IgM類抗體，對處理后血清進行倍比稀釋4、8、16、32……，取一張IgG亞型檢測卡，標記編號姓名，在檢測卡上面反應孔中分別加入倍比稀釋血清25ul和0.6% 標準試劑紅細胞懸液50ul,37℃條件下孵育15min，專用離心機離心5min,取出檢測卡判讀結果，同一份樣本進行IgG亞型定量分析，采用ELISA方法進行平行檢測，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行，對兩種方法的檢測結果進行統計學分析。

1.3 統計學方法:應用SPPSS 13.0軟件做統計學處理，孕婦IgG抗體亞型及各升高例數與HDN發病率的關系采用卡方檢驗,MGTA方法檢測結果以2為底數取對數后與ELISA方法檢測結果比較采用配對t檢驗、Spearman相關分析，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

MGTA檢測方法與ELISA方法之間實驗結果的一致性較好，前者操作更加簡便、快速，適合臨床常規可及的方法。新生兒及其母親體內IgG1和IgG3的含量與溶血的嚴重程度具有明顯的相關性，特別是IgG1的含量與血型不合HDN密切相關。

2.1 兩種方法檢測IgG亞型結果比較:對62例高效價孕婦采用MGTA法和ELISA方法平行檢測了IgG亞型，孕婦血清中各亞型檢測結果進行了比較，差異無統計學意義，t=0.3147,P>0.05，結果見表1。

表1 兩種方法檢測孕婦血型抗體IgG亞型試驗結果n(%)

注： *與ELISA方法比較，P>0.05

2.2 新生兒IgG亞型與溶血情況:新生兒經血清學溶血三項試驗檢測有27例可疑和確診與血型相關的HDN，采用兩種方法進行IgG亞型檢測，其中13例發生了ABO系統HDN,3例Rh系統HDN，部分患兒表現為多種亞型同時升高，9例重度HDN患兒實施了換血治療。兩種方法均檢測出產后溶血新生兒血清中IgG1、IgG3的含量升高, 多數以IgG1為主,二者比較差異無統計學意義(P>0.05),提示患兒血清中IgG1和IgG3的含量,特別是IgG1的含量與血型不合HDN存在較大的相關性, 換血的HDN新生兒血清中同時伴有IgG1和IgG3亞型含量增高，結果見表2。

表2 新生兒IgG亞型與溶血情況(n)

注： *換血的患兒均檢測到IgG1、IgG3同時升高

3 討 論

因母嬰血型不合引起的新生兒高膽紅素血癥在臨床上時有發生。產后新生兒能否出現高膽紅素血癥除了與血型抗體效價的高低有關系外，還與胎盤屏障保護作用、孕婦自身的免疫狀態、胎兒營養和耐受能力等多種因素有關[6,7]，有報道胎兒溶血輕重與IgG抗體亞型密切相關[8，9]。在IgG抗體的4個亞型中IgG1含量最高，其激活補體的能力也最強，而IgG2和IgG4亞型相對較弱。國內有文獻報道孕婦血液中血型抗體IgG1和IgG3亞型,特別是IgG1亞型的含量與ABO系統的HDN密切相關[10，11]。目前，臨床檢測IgG抗體亞型的試驗方法主要有酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和流式細胞儀檢測技術，這兩種方法的檢測試劑均為進口試劑，存在的不足是反應時間長、操作相對繁瑣、試劑價格昂貴，不適合普通實驗室常規應用。近年來，臨床輸血試驗中已經普遍采用微柱凝膠檢測技術(MGTA)[12]，我們自主研發了微柱凝膠技術檢測IgG抗體亞型的試驗方法，通過篩選最佳凝膠微粒、在微柱中包被IgG亞型的單抗，對檢測技術的特異性、穩定性和重復性等條件進行了優化，與流式細胞儀檢測技術進行比較和評價，成功構建了MGTA檢測血型抗體IgG亞型的試驗方法，試劑滿足國家關于微柱凝膠檢測卡的產品技術要求，并申請了國家專利(專利號201710386556.2)。本研究采用該技術與目前臨床常有的ELISA方法平行進行了高效價孕婦血型抗體IgG亞型檢測，二者的實驗結果呈明顯的正相關。國外文獻報道，在Rh系統引起的HDN試驗中, IgG1是胎兒紅細胞上致敏的主要抗體，約占溶血患兒總數的97%，IgG3占3%,并由此判斷IgG1是主要的致病抗體,但病情的進展和嚴重程度與IgG3有關。本研究結果也證實了這一點，IgG亞型的含量和臨床表現與文獻報道的基本相符。綜上所述，MGTA技術與ELISA方法兩種試驗在檢測血型抗體IgG亞型方面的結果一致性較好，我們建立的MGTA技術檢測血型抗體IgG亞型的試驗方法簡便、快速、靈敏度高、實用性強，一個小時即可完成檢測，普通實驗室即可常規開展，適合臨床實驗室推廣應用，對于早期診斷和干預治療母嬰血型不合HDN具有重要意義。