Akt/NF-κB信號通路介導(dǎo)NSC23766預(yù)先處理對呼吸機相關(guān)性肺炎大鼠內(nèi)皮功能的保護作用

徐 冬，余 健 ，陳 勇，薛 翠，宋玲英，陳 琳，孔天翔

機械通氣是臨床上為患者提供呼吸支持的常用重要治療手段，可以維持氣道通暢，但其使用不當時出現(xiàn)的氣壓傷、容積傷、切應(yīng)力傷及生物性損傷等均會引起肺組織損傷，造成呼吸機相關(guān)性肺損傷(ventilator-induced lung injury，VILI)[1]。研究顯示[2]，VILI損傷與肺血管內(nèi)皮細胞的結(jié)構(gòu)和功能改變密切相關(guān)，內(nèi)皮功能受損后，可引起肺動脈高壓、微循環(huán)障礙、動脈粥樣硬化等多種病理生理變化。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號通路是細胞內(nèi)調(diào)節(jié)炎性因子的最重要細胞因子，參與調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)等多種炎性因子的表達，在VILI損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[3]。近年來的研究顯示，Rac 1抑制劑可以抑制經(jīng)由Akt介導(dǎo)的NF-κB信號通路，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)炎癥反應(yīng)，保護VILI大鼠肺組織損傷[4]，但其對肺血管內(nèi)皮細胞的作用尚不清楚。因此，本研究基于Akt/NF-κB信號通路探討了Rac 1抑制劑NSC23766預(yù)先處理對VILI大鼠內(nèi)皮功能的保護作用及機制，旨在為VILI的治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 7500 RT-PCR系統(tǒng)購自于美國Applied Biosystems；電子天平(型號AUW220D，感量0.1 g)購自日本島津公司；小動物呼吸機(HX-101E)購自成都泰萌有限公司；IL-1β、IL-10和TNF-α試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；一氧化氮(NO)檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司；內(nèi)皮素-1(ET-1)檢測試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)引物由上海生工生物工程有限公司合成；辣根過氧化酶(HRP)標記兔抗鼠IgG，購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；β-actin鼠單克隆抗體、兔抗人單克隆抗體絲/蘇氨酸激酶(Akt)、p-Akt、NF-κB p65、p-NF-κB p65，均購自美國Abcam公司。

1.2實驗動物 選取SPF級SD雄性大鼠36只，體重均為200～220 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號SCXK(京)2015-0001，飼養(yǎng)于本院動物中心實驗室，保持室溫恒定為25℃，模擬晝夜光照，自由攝食與飲水。

1.3動物造模及給藥方法 大鼠預(yù)飼養(yǎng)1周后，隨機分為對照組、模型組和NSC23766組，每組12只。模型組和NSC23766組大鼠采用大潮氣量法復(fù)制VILI模型[5]， 2%戊巴比妥鈉溶液2 ml/kg腹腔注射進行麻醉，常規(guī)消毒皮膚，于大鼠頸部正中做一切口，暴露氣管，行氣管插管術(shù)，連接至小動物呼吸機，設(shè)置呼吸機參數(shù)：呼氣末正壓為0，呼吸頻率為40/min，氧氣濃度為21%，呼吸比為1∶1，潮氣量為40 ml/kg。對照組只行氣管切開，保留自主呼吸。大鼠在連接呼吸機前，NSC23766組經(jīng)氣管導(dǎo)管滴入NSC23766(1.5 mg/kg)預(yù)處理1 h，模型組和對照組經(jīng)氣管導(dǎo)管滴入等體積生理鹽水預(yù)處理1 h。機械通氣4 h后處死大鼠，結(jié)扎左肺門，用預(yù)冷PBS反復(fù)灌洗右側(cè)肺泡，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)，收集血液、BALF和左肺組織備用。

1.4大鼠肺組織病理學(xué) 取各組大鼠左肺下葉組織，濾紙吸干表面水分，采用電子天平稱取濕重后，置入75℃恒溫烤箱中烘烤3 d至恒重，稱取干重，計算濕重/干重(W/D)值。取大鼠左肺中葉組織，采用4%多聚甲醛固定，進行常規(guī)的脫水、透明、包埋和切片，進行蘇木精/伊紅(HE)染色，于光鏡下觀察肺組織的病理變化，每張切片隨機取5個視野拍照。

1.5大鼠BALF中相關(guān)指標檢測 取各組大鼠BALF，離心(2000 r/min，10 min)，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測IL-1β、IL-10、TNF-α水平，嚴格按試劑盒說明書進行測定；采用考馬斯亮藍染色法檢測BALF中總蛋白水平；采用細胞計數(shù)法檢測BALF中白細胞(WBC)數(shù)量。

1.6大鼠肺組織中NO和ET-1的檢測 取各組大鼠肺組織0.1 g，加入0.1 ml生理鹽水，勻漿，離心(3000 r/min，10 min)，取上清，采用硝酸還原酶法測定NO水平，放射免疫直接測定法檢測ET-1水平，嚴格按試劑盒說明書進行測定。

1.7大鼠肺組織中iNOS和eNOS mRNA表達水平 采用熒光定量PCR(RT-PCR)檢測iNOS和eNOS mRNA水平，取肺組織0.1 g，加入0.1 ml生理鹽水，勻漿，采用Trizol裂解液提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計檢測RNA純度和濃度，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，進行RT-PCR反應(yīng)，iNOS上游引物：5'-TAGAGGAACATCTGGCCAGG-3'，下游引物：5'-TGGCCGACCTGATGTTGCCA-3'；eNOS上游引物：5'-ATCCTGGCAGCCCTAAGACC-3'，下游引物：5'-TGGTAGCGTTGCTGATCCCG-3'，以GAPDH為內(nèi)參，計算各組iNOS和eNOS mRNA的相對表達量。

1.8Akt/NF-κB信號通路的表達 采用Western Blot法檢測，取肺組織，勻漿，采用細胞裂解液直接提取總蛋白檢測Akt和NF-κB p65的磷酸化水平，采用BCA法進行蛋白定量，取50 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，室溫密封2 h，采用TBST洗膜并加一抗Akt、p-Akt、NF-κB p65、p-NF-κB p65(稀釋比例均為1∶500)，于4℃孵育過夜，TBST洗膜加HRP標記的二抗(稀釋比例為1∶1000)，于室溫下孵育2 h。再用ECL化學(xué)發(fā)光顯示，收集影像，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析對比條帶強弱，選用β-actin作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.13組大鼠肺組織的病理變化 對照組大鼠肺組織細胞結(jié)構(gòu)完整，未見明顯病理變化。模型組大鼠肺組織可見肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔融合變大，伴大量炎性細胞浸潤。NSC23766組大鼠的肺組織病理損傷較模型組大鼠明顯減輕，炎性細胞浸潤明顯減少。見圖1。對照組、模型組和NSC23766組大鼠肺組織的W/D值分別為4.21±0.41、5.46±0.52、4.72±0.43。與對照組比較，模型組大鼠肺組織W/D值顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，NSC23766組大鼠肺組織W/D值顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 3組大鼠肺組織的病理變化(HE×200)

2.23組大鼠BALF中總蛋白和WBC比較 與對照組相比，模型組和NSC23766組大鼠BALF中總蛋白和WBC數(shù)值顯著增高，且模型組高于NSC23766組(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠BALF中總蛋白和WBC比較

注：BALF為支氣管肺泡灌洗液，WBC為白細胞；與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05

2.33組大鼠BALF中炎性因子比較 與對照組相比，模型組和NSC23766組大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高，且模型組高于NSC23766組(P<0.01)。見表2。

表2 3組大鼠BALF中炎性因子比較

注：BALF為支氣管肺泡灌洗液，IL-1β為白介素-1β，IL-6為白介素-6，TNF-α為腫瘤壞死因子-α；與對照組比較，bP<0.01；與模型組比較，dP<0.01

2.43組大鼠肺組織NO和ET-1水平比較 與對照組相比，模型組和NSC23766組大鼠肺組織中NO和ET-1水平顯著升高，且模型組高于NSC23766組(P<0.05)。見表3。

2.53組大鼠肺組織iNOS和eNOS mRNA表達水平比較 與對照組相比，模型組和NSC23766組大鼠肺組織中iNOS mRNA表達水平升高，且NSC23766組低于模型組(P<0.01)。與對照組相比，模型組和NSC23766組大鼠肺組織eNOS mRNA表達水平下降，且NSC23766組高于模型組(P<0.01)。見表4。

表3 3組大鼠肺組織NO和ET-1表達水平比較

注：NO為一氧化氮，ET-1為內(nèi)皮素-1；與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05

表4 3組大鼠肺組織iNOS和eNOS mRNA水平比較

注：iNOS為誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，eNOS內(nèi)皮型一氧化氮合酶；與對照組比較，bP<0.01；與模型組比較，dP<0.01

2.63組大鼠肺組織Akt/NF-κB表達水平比較 與對照組相比，模型組和NSC23766組大鼠肺組織中p-Akt/Akt和p-NF-κB p65/NF-κB p65表達水平明顯升高，且模型組高于NSC23766組(P<0.01)。見圖2和表5。

圖2 3組大鼠肺組織Akt、p-Akt、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達水平

表5 3組大鼠肺組織p-Akt/Akt和p-NF-κB p65/NF-κB p65表達水平比較

注：與對照組比較，bP<0.01；與模型組比較，dP<0.01

3 討論

VILI是機械通氣的嚴重并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為肺血管內(nèi)皮細胞損傷、血管通透性增加、肺水腫等，臨床尚無治療的特效藥物[6]；研究VILI發(fā)生發(fā)展的機制，對其治療和預(yù)防具有重要意義。文獻報道示，Rac 1抑制劑NSC23766可調(diào)節(jié)機體重要的NF-κB炎癥信號通路，保護腎組織細胞損傷[7]，但對VILI內(nèi)皮功能的影響報道較少。目前臨床常用較大潮氣量、較高通氣壓力、破壞肺表面活性物質(zhì)等方法來復(fù)制VILI動物模型，其中較大潮氣量法較常用且操作簡單[8]。故本研究采用較大潮氣量法復(fù)制大鼠VILI模型，分析NSC23766預(yù)處理對VILI大鼠血管內(nèi)皮功能的影響。W/D值可反映肺組織的含水量變化，臨床常用其反映肺水腫嚴重程度[9]，本研究結(jié)果顯示，NSC23766組大鼠肺組織W/D值低于模型組，提示NSC23766預(yù)處理可減輕VILI大鼠肺組織水腫，保護肺組織。BALF中總蛋白和WBC數(shù)值反映了肺組織毛細血管的通透性變化和肺組織的炎性因子水平[10]，IL-1β、IL-6和TNF-α均為活化的單核/巨噬細胞合成并分泌的致炎因子，可誘導(dǎo)多種炎性介質(zhì)產(chǎn)生，參與肺組織損傷后的細胞水腫、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡等病理過程，加重肺組織損傷[11-12]。本研究結(jié)果顯示，NSC23766組大鼠BALF中總蛋白、WBC數(shù)值、IL-1β、IL-6和TNF-α低于模型組。提示NSC23766預(yù)處理可以降低毛細血管通透性并抑制炎性因子釋放，保護肺組織，減輕肺損傷。

本研究結(jié)果顯示，NSC23766組eNOSmRNA高于模型組，NO、EF-1、iNOSmRNA低于模型組，提示NSC23766預(yù)處理干預(yù)可以促進肺組織eNOS的表達，抑制iNOS的表達，降低VILI大鼠肺組織ET-1和NO水平，且隨著濃度升高，其作用逐漸增強。iNOS和eNOS是合成NO的關(guān)鍵限速酶，其中eNOS合成的低濃度NO可以抑制ET-1的分泌，發(fā)揮其擴血管、抑制血管平滑肌增殖的生物效應(yīng)，而在炎性因子等刺激下活化的iNOS可產(chǎn)生大量的NO，過量的NO具有細胞毒性作用，可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞損傷[13]。ET-1和NO是由血管內(nèi)皮細胞分泌的調(diào)節(jié)血管舒縮的細胞因子，ET-1可以促進血管平滑肌增殖，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞損傷[14]。左艇等[15]報道，NO和ET-1水平變化與肺血管內(nèi)皮細胞損傷密切相關(guān)，提示NSC2766預(yù)處理可能通過調(diào)節(jié)肺組織iNOS和eNOS的表達，降低肺組織NO和ET-1水平，調(diào)節(jié)血管的舒縮作用，保護肺血管內(nèi)皮細胞功能。

本研究結(jié)果顯示，NSC23766組p-Akt/Akt和p-NF-κB p65/NF-κB p65表達低于模型組，提示NSC23766預(yù)處理可降低VILI大鼠肺組織Akt和NF-κB的磷酸化。NFκB信號通路是細胞內(nèi)最重要的調(diào)控炎性因子的信號通路，在VILI發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[3]。文獻報道，在生理狀況下NF-кB與IκB結(jié)合處于被抑制狀態(tài)，一旦發(fā)生磷酸化被激活，可釋放NF-κB/p65進入胞核與靶序列結(jié)合，促進下游TNF-α等炎性細胞因子的表達，加重組織損傷[16]。Lu 等[17]報道，NSC23766可以抑制Akt的磷酸化抑制NF-кB信號通路，參與調(diào)節(jié)機體的炎癥反應(yīng)，提示NSC23766可能通過抑制Akt的磷酸化抑制NF-кB信號通路，降低VILI大鼠的炎癥反應(yīng)。Sara等[18]報道，甘草查爾酮C可以抑制NF-κB/iNOS/NO信號通路，保護脂多糖誘導(dǎo)H9c2細胞損傷，提示NSC23766預(yù)處理可能通過抑制Akt/NF-κB信號通路，調(diào)節(jié)iNOS和eNOS的表達，降低炎性因子水平，保護肺血管內(nèi)皮細胞功能，減輕肺組織損傷。

綜上所述，NSC23766預(yù)處理可能通過抑制VILI大鼠Akt/NF-κB信號通路，調(diào)節(jié)其肺組織中iNOS和eNOS的表達，降低肺組織炎性因子、NO和ET-1水平，保護肺血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)和功能，減輕肺組織損傷，有望應(yīng)用于臨床VILI的預(yù)防和治療。