磷酸甘油酸激酶1與乳腺浸潤癌患者預后的相關性及潛在機制探索

郭 然，侯世科，陳孝儲

乳腺癌是近年來女性中發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，在我國每年新發(fā)的病例約有27.9萬，并以2%的速度逐年增長[1]。盡管當前的一系列綜合治療措施使早期乳腺癌患者的生存率大幅度提高，但仍有約30%的患者會在遠期出現(xiàn)復發(fā)或轉移[2]。因此進一步尋找能夠提示乳腺癌患者預后指標并完善其治療策略，對于提高該類患者的治療效果尤為重要。磷酸甘油酸激酶1 (phosphoglycerate kinase 1, PGK1) 是糖酵解過程中一種重要的催化酶，有研究表明，其在肝細胞癌、結腸癌、胰腺癌、腎細胞癌等多種癌癥中均會異常表達，并調(diào)控腫瘤細胞的增殖和轉移[3-6]。但PGK1在乳腺癌患者中能否作為一種提示患者預后的指標仍有待進一步探索，其作用機制也有待更為深入的挖掘，故本研究擬通過公開的癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫和生物信息學方法分析PGK1對乳腺浸潤癌患者腫瘤分期及生存率的影響，以及潛在的相關機制，從而為乳腺浸潤癌的預后判斷和治療指導方面提供一定的參考。

1 資料和方法

1.1生存曲線分析 從包含TCGA數(shù)據(jù)網(wǎng)站(http://www.linkedomics.org)下載乳腺浸潤癌患者數(shù)據(jù)集TCGA_BRCA RNASeq和TCGA_BRCA Clinical，篩選出同時包含基因表達數(shù)據(jù)和生存時間數(shù)據(jù)信息的患者共1051例。按照PGK1基因的表達水平由高到低進行排序，將排在前50%的患者設為高表達組(n=526)，其余患者設為低表達組(n=525)，并應用GraphPad Prism 軟件繪制2組患者的生存曲線。

1.2PGK1在不同腫瘤分期中的比較 篩選出同時包含腫瘤分期信息和基因表達水平的患者數(shù)據(jù)，根據(jù)腫瘤的TNM分期，將患者分別歸入相應的各組，比較不同分期乳腺浸潤癌患者的PGK1基因相對表達水平。

1.3PGK1相關基因篩選 利用Omisc軟件，將患者檢測的所有基因表達水平逐一與PGK1表達水平進行相關性檢驗，根據(jù)相關系數(shù)選取與PGK1表達相關性最高的50個基因，并繪制基因熱圖[7]。

1.4富集分析 將篩選出的50個相關基因導入String在線數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)進行基因本體(gene ontology, GO)富集分析(生物學過程、 細胞組成、分子功能)和京都基因與基因組百科全書通路(the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Pathway, KEGG 通路)富集分析。

2 結果

2.1PGK1表達差異對生存時間的影響 PGK1高表達組乳腺浸潤癌患者的中位生存時間低于PGK1低表達組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 2組乳腺浸潤癌患者生存曲線比較

PGK1為磷酸甘油酸激酶1

2.2不同分期乳腺浸潤癌患者PGK1表達水平比較 ①根據(jù)臨床分期將乳腺浸潤癌患者分組，則4組間PGK1表達水平差異有統(tǒng)計學意義(F=6.079，P<0.01)。Ⅰ期患者PGK1表達水平顯著低于Ⅱ～Ⅳ期的患者，IV期患者PGK1表達水平顯著高于Ⅰ～Ⅲ期的患者(P<0.05)。②根據(jù)病理學T分期，4組間PGK1表達水平差異有統(tǒng)計學意義(F=8.373，P<0.01)，T2期患者PGK1表達水平顯著高于T1期和T3期患者，T4期患者PGK1的表達水平均高于其他3期的患者(P<0.05)。根據(jù)N分期4組間PGK1表達水平差異無統(tǒng)計學意義(F=0.860，P=0.461)。根據(jù)M分期，M1期患者PGK1表達水平高于M0期患者(t=-2.77，P=0.006)。見圖2。

圖2 不同分期乳腺浸潤癌患者PGK1表達水平比較

PGK1為磷酸甘油酸激酶1

2.3PGK1相關基因的篩選 在檢測的20 154個基因中，有11 872個基因與PGK1存在相關性(P<0.05)，見圖3A。選取與PGK1表達相關系數(shù)最高的前50個基因，并繪制基因熱圖，見圖3B。其中細胞死亡誘導DFFA樣效應因子c(Cell death-inducing DFFA-like effector c， CIDEC)和水通道蛋白7(Aquaporin-7， AQP7)與PGK1表達水平的相關系數(shù)最高(分別為r=0.8220，P<0.05；r=0.8216，P<0.05)。見圖3C和3D。

2.4GO富集分析和KEGG通路富集分析 對篩選的50個基因進行GO富集分析可見，主要涉及的生物學過程包括代謝過程、對刺激的反應、生物調(diào)節(jié)、多細胞組織過程和細胞通訊；主要涉及的細胞組分為膜、細胞外空間、囊、細胞質和內(nèi)膜系統(tǒng)；主要涉及的分子功能為蛋白質結合、離子結合、轉運活動、水解酶活性和脂質結合。見圖4。KEGG通路富集分析可見主要涉及的信號通路為PPAR信號通路、調(diào)節(jié)脂肪細胞中的脂肪分解、AMPK信號通路、脂肪細胞因子信號通路和酪氨酸代謝通路。

3 討論

PGK1由417個氨基酸組成，是糖酵解途徑中的一種重要催化酶，可催化 1，3-二磷酸甘油酸和ADP 生成3-磷酸甘油酸和1分子ATP，為生理過程提供所需能量[8]。近年來研究發(fā)現(xiàn),PGK1還在多種腫瘤中高表達并發(fā)揮調(diào)控腫瘤細胞增殖與轉移的作用。Wang等[9]在前列腺癌細胞中發(fā)現(xiàn)，PGK1高表達可通過抑制黏附相關蛋白E-鈣黏素的表達，從而降低細胞之間的黏附，增加腫瘤細胞的侵襲能力。Xie等[10]發(fā)現(xiàn)PGK1在肝細胞癌組織中存在顯著過表達，且PGK1的過表達與肝細胞癌患者的不良預后相關。抑制PGK1表達后可顯著降低癌細胞的增殖和轉移，但是在乳腺浸潤癌中PGK1是否同樣發(fā)揮重要作用卻鮮有報道。本研究通過對公開數(shù)據(jù)庫的挖掘發(fā)現(xiàn)，PGK1高表達的乳腺浸潤癌患者遠期生存率更低，且病理分期越高的患者，PGK1表達水平越高，這表明PGK1可提示乳腺浸潤癌患者預后不良。與Fu等[11]研究結果類似，該研究發(fā)現(xiàn)敲低PGK1表達可通過影響缺氧誘導因子1α的功能，逆轉乳腺浸潤癌細胞的上皮-間質轉化過程，并顯著抑制腫瘤細胞侵襲。這可能與腫瘤細胞代謝特點有關，正常細胞在向惡性腫瘤轉化的過程中往往伴隨著代謝途徑的重塑，即無論氧供是否充足，都主要依靠糖酵解途徑供能，也稱為warburg效應，這也是腫瘤細胞為了適應自身過快增殖而造成的低氧低糖微環(huán)境所發(fā)生的一種改變[12]。

圖3 PGK1相關基因篩選結果

A.PGK1與各基因的相關性分析結果；B.與PGK1表達相關系數(shù)最高的前50個基因；C.CIDEC基因與PGK1表達的相關系數(shù)基因；D.AQP7基因與PGK1表達的相關系數(shù)；CIDEC為細胞死亡誘導DFFA樣效應因子c，AQP7為道蛋白7

圖4 GO富集分析

PGK1是糖酵解途徑中重要的催化酶之一，其高表達可提高腫瘤細胞的代謝水平，增強腫瘤對無氧環(huán)境的適應能力[13]。但除了在糖酵解發(fā)揮重要作用外，PGK1是否還參與到了其他的信號通路從而影響乳腺腫瘤患者預后仍有待深入探索，為此本研究進一步探索了與PGK1表達相關系數(shù)較高的基因及其相關機制。本研究結果顯示，CIDEC基因和AQP7與PGK1表達水平的相關系數(shù)最高，CIDEC基因又被稱為脂肪特異性蛋白27，該基因位于 3 號染色體 3p25，編碼一個細胞死亡誘導DNA碎片因子樣效應子家族的成員，蛋白分子量為 27.3 kDa，其在脂肪組織中的表達水平最高，可促進脂肪細胞內(nèi)脂滴的形成，并可能介導脂肪細胞的凋亡[14]。Grahn等[15]報道，CIDEC在人脂肪細胞中過表達，其可增加細胞中甘油三酯含量并降低脂肪分解作用，而敲除將小鼠的 CIDEC基因可見機體對儲存脂肪酸的消耗增加[16]，這提示CIDEC或許可通過促進脂肪蓄積，從而提高腫瘤組織能量供應，促進腫瘤生長。

AQP7是水通道蛋白家族13個成員之一，其編碼的蛋白質定位在質膜上，允許水、甘油和尿素在細胞膜上運動，該基因同樣在脂肪組織中呈高表達，在脂肪組織中編碼的蛋白有利于甘油的流出[17]。既往研究發(fā)現(xiàn)AQP7與多種腫瘤的發(fā)生相關，其過表達可促進腫瘤細胞的遷移與增殖，并參與腫瘤的血管生成、局部侵襲和遠處轉移，有研究表明AQP7在乳腺中分布較為廣泛，其高表達可能一方面通過增加微血管的水滲透性參與細胞生長，另一方面通過調(diào)節(jié)細胞膜對甘油的通透性而提高腫瘤組織的能量供應[18]。富集分析結果可見，PGK1可以預測乳腺浸潤癌患者預后不良的潛在機制主要涉及其對物質代謝的影響，特別是脂質的代謝，這也與腫瘤組織無限增殖需要大量能量供應相一致。

綜上所述，本實驗通過數(shù)據(jù)挖掘證實PGK1在提示乳腺浸潤癌患者預后中發(fā)揮重要作用，這可能與其通過調(diào)控物質代謝水平，從而為腫瘤細胞提供更多能量，促進腫瘤細胞生長有關，這為乳腺浸潤癌的機制和藥物治療研究提供了一定參考；但同時PGK1可能涉及多條信號通路，這仍有待于進一步研究。