滋養層細胞表面抗原2和DNA甲基轉移酶1在鼻咽癌中的表達及與其臨床病理特征的相關性分析

李志偉，繆 琴，王 為

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma， NPC)是一種發生于鼻咽部的惡性腫瘤，是我國高發惡性腫瘤之一[1]。在NPC疾病初期，患者癥狀均較輕且常見，故未引起重視，多數患者就診時已發展至疾病中晚期[2]。目前臨床上常通過CT及核磁共振成像(MRI)等檢查對NPC患者的病情分期及治療進行有效評估。放療是臨床上針對NPC的首選治療方法，可有效控制其病情，但仍有少數患者治療后再復發甚至發生惡化轉移，故對NPC發生及病變過程中患者體內相關生物分子表達情況進行研究于患者預后具有重要指導意義[3]。滋養層細胞表面抗原2(trophoblast cell surface antigen 2, Trop2)是一種存在于細胞表面的糖蛋白，對惡性腫瘤的遷移與侵襲具有調控作用[4]。而DNA甲基化在全身各類細胞發育過程中也具有積極作用，其中最為常見且發揮作用的就是DNA甲基轉移酶1(DNA Methyltransferase 1, DNMT1)[5]。目前臨床上對于Trop2與DNA甲基化對NPC病變過程的影響的研究較為少見[6]。本研究通過對本院確診131例NPC患者的臨床資料進行探究，分析Trop2、DNMT1的表達與該類患者臨床病理特征的相關性。現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析我院2014年5月—2019年5月收治的131例NPC患者的臨床資料，男96例，女35例；年齡22～64(42.38±7.26)歲。臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期86例。 ①納入標準：符合NPC診斷標準且經病理檢查結果證實[7]；術前未行抗癌輔助治療；患者對本研究知情,并簽署同意書。 ②排除標準：伴嚴重系統性疾病；合并全身其他類型惡性腫瘤。本研究經醫院醫學倫理委員會審核通過，臨床資料均完整。

1.2儀器與試劑 10%甲醛溶液、石蠟、Trazol溶液(日本Takara公司)、PCR儀(美國ABI-7500 Real-Time PCR)、通用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(SP)試劑盒、兔抗人Trop2多克隆抗體(英國Abcam公司)、羊抗人DAMT1多克隆抗體(英國Abcam公司)、經HRP標記的羊抗鼠及羊抗兔抗體(美國Earthox公司)。

1.3檢測方法

1.3.1Trop2表達水平檢測：取患者鼻咽部黏膜組織，在30 min內將黏膜組織置于10%甲醛溶液中固定浸泡，石蠟包埋切片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇予以脫水，并使用枸櫞酸鹽修復液對組織進行3 min的高壓修復，修復完成后用免疫組化筆在受檢組織1～2 mm外劃圈，再加入3% H2O2放置于恒溫箱中孵育20 min，以阻斷內源性過氧化物酶干擾，并運用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，漂洗3次后加入適量的10%正常羊血清于室溫下密閉15 min，棄血清，并以1∶500的稀釋比例滴加兔抗人Trop2多克隆抗體放置于4℃的恒溫箱中過夜，再用PBS漂洗3次，并予以DAB顯色、蘇木素復染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。各組標本均將PBS代替一抗作為陰性對照，以自身對照作為陽性對照。

1.3.2DNMT1表達水平檢測：取患者鼻咽部黏膜組織，由相關專業人員用Trazol溶液將黏膜組織樣本和總RNA進行提取，并嚴格按照試劑盒說明合成cRNA。設計DNMT1引物，DNMT1上游序列5'-GATGATTCCTCAAAACCGCTGTA-3'；下游序列5'-GTAGGTCTTCCCGTCGTCCC-3'。合成完畢后取所有患者的cDNA 5 μl，將其作為模板，再分別加入至2 μl 10×buffer和4 μl H2O中，并經過高溫變性、循環，再進行PCR儀檢測。將PCR產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，參考DL 2000 marker分子質量標準進行紫外凝膠掃描成像，該樣本的表達相對強度則為與樣本內對照β-actin的熒光強度比值。所有操作均嚴格遵循說明書要求執行。

1.4Trop2及DNMT1蛋白免疫組織學結果判定標準 參照參考文獻[8]進行判定：由兩位病理科醫生在400倍光鏡下隨機選取10個視野對染色細胞數量和染色程度進行評分。①陽性細胞數量：<1%為0分，1%～10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分。②染色程度：無染色為0分，弱陽性顯黃色為1分，中等陽性顯淺棕色為2分，強陽性顯棕褐色為3分，并將二者所得分數合計，0～3分為無表達或低表達，4～6分為高表達。

2 結果

2.1NPC患者癌組織和癌旁組織的Trop2及DNMT1蛋白表達水平比較 NPC患者鼻咽組織Trop2、DNMT1陽性表達于細胞膜上，于其細胞膜處可見較多的棕色顆粒。見圖1。NPC組織的Trop2、DNMT1蛋白表達水平顯著高于癌旁組織,差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

圖1 NPC癌組織中DNMT1和Trop2蛋白表達(SP×100)

A. DNMT1蛋白表達；B. Trop2蛋白表達；NPC為鼻咽癌，DNMT1為DNA甲基轉移酶1，Trop2為滋養層細胞表面抗原2

表1 Trop2及DNMT1蛋白在NPC癌組織和癌旁組織的表達水平比較[例(%)]

注：NPC為鼻咽癌，Trop2為滋養層細胞表面抗原2，DNMT1為DNA甲基轉移酶1；與癌旁組織比較，bP<0.01

2.2NPC癌組織中Trop2、DNMT1蛋白表達與患者臨床病理特征的關系 NPC癌組織中Trop2、DNMT1的蛋白表達水平與患者性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。NPC患者TNM分期處于Ⅲ～Ⅳ期、伴淋巴結轉移者Trop2、DNMT1的蛋白表達水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移者，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 NPC癌組織中Trop2、DNMT1蛋白表達水平與患者臨床病理特征的關系[例(%)]

注：NPC為鼻咽癌，Trop2為滋養層細胞表面抗原2，DNMT1為DNA甲基轉移酶1

2.3NPC患者Trop2、DNMT1蛋白表達與臨床病理特征的相關性分析 經Spearman相關性分析，結果顯示，NPC患者Trop2、DNMT1蛋白表達水平與TNM分期、淋巴結轉移程度呈正相關(P<0.05)。見表3。

表3 NPC患者Trop2、DNMT1的表達與臨床病理特征的相關性分析

注：NPC為鼻咽癌，Trop2為滋養層細胞表面抗原2，DNMT1為DNA甲基轉移酶1

3 討論

NPC是我國最常見的惡性腫瘤之一，具有高度的侵襲性和轉移性，好發于南方各省，發病具有明顯的種族、家族和地區聚集現象[9]。據相關數據顯示，全世界80%的NPC發生在我國，多見于30～50歲的患者，男∶女為2～3∶1[10]。NPC患者常出現鼻塞、涕中帶血、頭暈頭痛、聽力下降、耳鳴以及復視等癥狀，且老年人和年輕人均有可能發生，對人們的健康造成了嚴重影響[11]。NPC早期患者5年生存率可達70%以上;若疾病惡化發展至晚期，5年生存率僅為8%～10%，故該疾病的發病機制及病理分期可影響患者后續治療及生活質量[12]。

大多數學者均認為NPC的發病與EB病毒感染、吸煙、遺傳及環境因素有關；然而近年來有相關學者研究發現，DNA甲基化及滋養層細胞表面抗原在NPC發病的過程中具有重要意義[13-14]。DNA甲基化對胚胎發育、細胞分化及基因調解具有重要作用，若DNA甲基化發生異常可導致正常基因功能中斷并引發各類疾病[15-16]。不同形式的異常DNA甲基化常發生于惡性腫瘤患者機體中:發生某些基因和重復序列的高度甲基化、抑癌基因的高度甲基化及DNA甲基化轉移酶(DNMTs)表達異常等[17]。DNMT是調節DNA甲基化的關鍵因子之一，臨床研究發現，存在于人體中且具有活性的DNMTs僅有3個:DNMT1、DNMT3a、DNMT3b，且不同的DNMT在腫瘤組織中表達水平不均一[18]。有報道稱DNMT1和DNMT3b在胃癌中呈高表達水平，在一定程度上誘導了DNA甲基化[19]。Trop2是一種在滋養層細胞中發現的跨膜糖蛋白[20]。有相關學者研究發現，Trop2在健康機體的表達較低，而廣泛表達于大量腫瘤患者機體中，且與腫瘤的性質、TNM分期、分化程度、淋巴結轉移程度等存在密切聯系[21]。本研究中結果顯示，Trop2、DNMT1蛋白在NPC癌組織中呈高表達狀態，且明顯高于癌旁組織；伴隨有淋巴結轉移及TNM分期處于Ⅲ～Ⅳ期的NPC患者的Trop2、DNMT1蛋白表達水平更高。這有效的驗證了上述研究的說法，而在臨床上，伴淋巴結轉移NPC晚期患者預后較差，這也在一定程度上說明了，Trop2、DNMT1蛋白表達水平與該疾病的預后具有一定的相關性。本研究對NPC患者Trop2、DNMT1表達水平與病理特征的相關性進行分析發現，Trop2、DNMT1蛋白表達水平與TNM分期、淋巴結轉移程度呈正相關，與陳順金等[22]及劉宇軒[23]研究結果一致。

綜上所述，NPC患者Trop2、DNMT1蛋白表達水平與其病理分期及淋巴結轉移情況具有相關性。臨床治療上可根據Trop2、DNMT1蛋白表達情況對患者病情評估與治療指導，可通過有效抑制DNMT1、Trop2的表達來抑制惡性腫瘤的發生。