他克莫司促進顱腦損傷大鼠誘導周圍神經再生的研究

何新澤 林書卿 楊濤 王成剛 李芹 薛惠萍 高麗麗 李玲玲(濱州市中心醫院 山東 濱州 251700）

臨床上常見到顱腦損傷合并周圍神經損傷的患者，神經損傷獨特的病理生理過程，導致神經功能恢復不全，生活質量下降[1]。王維、何新澤等通過建立腦損傷模型發現大鼠在顱腦損傷合并的周圍神經損傷，修復速度加快[2]；大量研究證實他克莫司促進神經損傷修復再生[3]。他克莫司主要通過免疫抑制、神經營養來促進周圍神經損傷后的再生[4-7]。本實驗通過比較神經恢復情況，探索顱腦損傷促進神經損傷恢復的機制。

1.資料和方法

1.1 造模動物及材料

實驗在2018年10月—2019年02月在濱州市中心醫院完成。

實驗動物：選用SPF級雄性SD大鼠180只，200～220g（北京維通利華SCXK(京)2012-0001）。飼養條件：晝夜各12 h、溫度23±1℃。將大鼠完全隨機分為4組，每組45只。實驗經過濱州市中心醫院倫理委員會批準，按照國際動物實驗標準執行。

主要設備及試劑：手術顯微鏡（LZL-6A型，鎮江中天公司），光學顯微鏡（BH-3型，Olympus公司），他克莫司100mg（Selleck)，頭孢唑啉納（魯抗制藥，國藥準字H19993050）、甲苯胺藍（Sigma）、BL-420F系統（成都泰盟科技有限公司）、熒光金（Sigma），冰凍切片機（Leica819）。

1.2 造模方法：

1.2.1造模步驟：禁食水4小時，術區備皮剪毛。術前30分鐘，體重100g給予肌肉注射頭孢唑啉鈉10mg，體重100g給予10%水合氯醛按照0.35ml腹腔全麻；A組（顱腦損傷+坐骨神經損傷）：碘伏消毒，在頭部正中矢狀切開，顱骨開窗處位于冠狀線后1.5mm、中線偏左5mm，骨窗直徑5mm，撞擊造成中度腦損傷；右側臀部，顯微鏡下完全切斷坐骨神經，9～0無損傷線縫合坐骨神經外膜4～6針[8]。B組 （坐骨神經損傷）：顯微鏡下完全切斷右側坐骨神經，縫合坐骨神經外膜。

1.2.2造模后的干預：他克莫司用0.9%氯化鈉稀釋，0.9%氯化鈉他克莫司（1ml：1mg），現用現配制；造模手術12小時后，A1組大鼠按體重100mg給予他克莫司0.5mg腹腔注射，A兩組給予等量生理鹽水腹腔注射，B1組大鼠按體重100mg給予他克莫司0.5mg腹腔注射，B兩組大鼠給予等量生理鹽水腹腔注射。每日應用1次，持續2周。

1.3 觀察指標

1.3.1坐骨神經干動作電位恢復率測定：造模后8周、12周進行測定，每組每次隨機取5只大鼠，麻醉后，暴露坐骨神經，在神經吻合口遠端0.5cm放置刺激電極1，吻合口近端放置刺激電極2，將記錄到的電信號直接輸入BL-420F系統中。

1.3.2 坐骨神經的甲苯胺藍染色：造模后4周、8周、12周，每組每次隨機取5只大鼠，橫行切片4um,1%甲苯胺藍染色20分鐘，快速酒精分色，中性樹膠封片，觀察神經纖維的髓鞘再生情況。

1.3.3熒光金示蹤：造模后12周，微量注射器在坐骨神經斷端以遠0.5cm處，注入4%的熒光金溶液5μl，2分鐘后緩慢退針。術后7天，灌流固定，取坐骨神經對應脊髓節段，冰凍切片脊髓橫斷面20μm。熒光顯微鏡下觀察脊髓前角熒光金陽性運動神經元數目。

1.4 統計學分析

數據采用SPSS19.0統計軟件進行統計學分析，計數資料采用率（%）表示，進行χ2檢驗，計量資料采用（±s）表示，進行t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2.結果

造模后大鼠基本生活狀態的觀察：造模后所有動物均存活，切口無感染。造模1周后B兩組大鼠出現足部紅腫明顯，其他組紅腫較輕。造模3周后，A2、B1、B兩組大鼠足跟出現程度不同的潰瘍面，A1組大鼠足部未見明顯潰瘍；造模12周后，各組大鼠足部潰瘍基本痊愈，B兩組大鼠出現足部的自食現象。

2.1 坐骨神經干的動作電位幅值恢復率

造模第8周，各組大鼠坐骨神經干的動作電位幅值恢復率差異有統計學意義（P ＜0.01），A1優于A2、B1、B兩組、A2優于B1、B兩組、B1優于B兩組；第12周時，A2與B1組大鼠坐骨神經干的動作電位幅值恢復率接近（P＞0.05），A1優于A2、B1、B兩組，A2優于B兩組，B1優于B兩組(P ＜0.01），見表。

表 腦損傷、FK506對周圍神經損傷大鼠神經干動作電位恢復率的影響（±s）

表 腦損傷、FK506對周圍神經損傷大鼠神經干動作電位恢復率的影響（±s）

組別8周12周 A182.56±1.6388.37±1.59 A264.21±3.0276.24±3.52 B147.64±2.3575.60±2.53 B245.33±3.0348.60±3.01

腦損傷、FK506對周圍神經損傷大鼠神經干動作電位恢復率（%）的影響（實驗條件：屏蔽櫥內進行，室溫25±0.5℃，刺激強度1.2mv、波寬0.05ms）。

2.2 造模4周后，A1組可見Schwann細胞形成的神經內膜管，A2、B1組未形成神經內膜管，B兩組可見大量單核細胞核、散在Schwann細胞核；造模后8周、12周，A1組再生有髓神經纖維髓鞘較A2、B1、B兩組厚且規則，A2、B1組髓鞘厚度無顯著差異，A2、B1組髓鞘較B兩組厚（見圖1）。

圖1. 坐骨神經甲苯胺藍染色（×400）

4周：A1組可見Schwann細胞形成的神經內膜管，A2、B1組未形成神經內膜管，B兩組可見大量單核細胞核、散在Schwann細胞核；8周、12周：A1組再生有髓神經纖維髓鞘較A2、B1、B兩組厚且規則，A2、B1組髓鞘厚度無顯著差異，A2、B1組髓鞘較B兩組厚。

2.3熒光金示蹤標記：光鏡下，觀察各組相應脊髓節段前角神經元細胞胞漿中熒光顆粒，（見圖2）。每高倍視野下進行計數，統計統計分析結果；造模后第12周，各組脊髓神經元胞漿熒光金標記陽性率率差異有統計學意義，A2與B1組大鼠脊髓神經元胞漿HRP標記陽性率接近（P＞0.01），A1高于A2、B1、B兩組，A2高于B兩組，B1高于B兩組(P＜0.01）。

圖2 術后12周脊髓前角熒光金陽性神經元（×100）

第12周時，A兩組HRP標記脊髓前角陽性率77.24±1.52%與B1組大鼠脊髓神經元胞漿熒光金標記陽性率78.60±2.23%接近（P＞0.01），A1組熒光金標記脊髓前角陽性率82.37±1.33%高于A兩組77.24±1.52 %、B1組78.60±2.23%、B兩組42.63±2.12%，A兩組熒光金標記脊髓前角陽性率高于B兩組42.63±2.12%，B1組熒光金標記陽性率78.60±2.23%高于B兩組42.63±2.12%(P＜0.01）。

3.討論

何新澤等通過動物實驗發現大鼠腦損傷后伴隨損傷坐骨神經的修復重建明顯加快，但具體修復機制尚不清楚[3-5]。本實驗通過比較顱腦損傷聯合應用他克莫司的坐骨神經損傷恢復情況。在所有的實驗觀測項目中，A1組（顱腦損傷聯合他克莫司）大鼠的坐骨神經修復效果要優于其他組，證實顱腦損傷可以與他克莫司協同促進坐骨神經損傷后的修復，其作用機制與他克莫司不完全相同。

周圍神經SunderlV的損傷，切斷了神經內分泌的營養支持。神經內分泌產生的物質不能輸送到靶器官上，靶器官將失去活性和營養的支持。目前他克莫司促進神經修復明確是兩個功能領域，發揮神經營養功能，形成一個FKBP12的綜合體，加入功能區域后表達GAP-43，并促進形成和擴大神經的生長由神經脈沖生成的生物電能，再生軸突的內徑上升，形成厚厚的神經膜層，作用范圍增加[1，3]。這證實了他克莫司有助于恢復周圍神經的營養功能，坐骨神經動作電位恢復率、神經甲苯胺藍染色，提示促進周圍神經損傷的作用，結合功能或復雜的FKBP12 地區來促進表達GAP-43。

在周圍神經損傷后，軸突的退化立即發生，軸突碎片是由巨噬細胞吞噬清除的，新的軸突、未退化的神經元延伸到由Schwann細胞組成的內膜神經的間隙，靶器官逐漸建立聯系和營養[1-3]。靶器官的恢復熒光金神經顯示，A1組在他克莫司的免疫抑制效果方面優于A2/B1/B兩組，他克莫司結合FKBP12，形成鈣復合物抑制堿（CAN），抑制T細胞的衰減，并抑制IL-2、IL3的表達，以生產免疫抑制物[4-7]被神經接收。

周圍神經的損傷伴隨著血液神經屏障的破壞，刺激纖維增生和巨噬細胞的擴散，形成影響神經修復的疤痕[4-7]。他克莫司可以抑制纖維素的擴散、遷移和生物活性，抑制纖維素的擴散，并通過免疫抑制作用促進神經損傷的重建和修復。神經內分泌系統的調節，創造微型環境的因素、Schwann細胞的信號有助于促進軸突再生[1]。軸突內物質更好地恢復運輸功能和靶器官的反饋是相互促進的[1，5]。熒光金染色證明A1比 A2/B1/B兩組免疫神經內分泌系統在腦損傷期間有密切的關系[6]，自主神經系統的中心結構被摧毀，導致免疫調節紊亂、改變或喪失，功能腦細胞的變性，導致caspase瀑布反應性的激活，導致神經凋亡。

本試驗結果提示大鼠顱腦損傷伴隨周圍神經損傷動物早期應用他克莫司后，周圍神經修復再生方面較好，腦損傷、他克莫司均可促進周圍神經損傷的修復，并且協同促進神經損傷的修復效果更好，為腦損傷合并周圍神經損傷的患者提供了新的治療思路。但腦損傷促進周圍神經損傷的具體機制仍需進一步深入研究。