SIRT1在NMDA誘導的肺泡上皮細胞損傷中的保護作用*

杜航航 吳治紅 陶家榮 趙四俊 馬帥志 彭湘萍

吉首大學醫學院 1 臨床醫學系16級 2 生理教研室, 湖南省吉首市 416000

急性肺損傷(ALI)是指在炎癥感染、休克等致傷因素作用下，肺毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞損傷造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，這些變化導致肺容積減少、肺順應性降低、嚴重的通氣/血流比例失調，最終可引起急性呼吸功能不全，其發病率和死亡率較高[1]。

沉默信息調節因子1(SIRT1)是一種Ⅲ型去乙酰化酶，其參與細胞衰老、抗氧化應激、抑制炎癥反應和能量代謝調節等多種細胞功能活動[2]。大鼠腸道缺血再灌注誘導的急性肺損傷中，肺部 SIRT1 表達降低而肺 TNF-α、IL-6、IL-1β水平的上升，這些研究提示SIRT1在肺部炎性反應中扮演重要角色[3]。

N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體屬于離子型谷氨酸受體，廣泛表達于中樞神經系統，在興奮性突觸傳遞及學習記憶中起關鍵作用。近年來研究表明NMDA受體也分布于非神經組織和細胞中，包括：肺臟、腎臟、胰島β細胞、血管[4]。特異性阻斷NMDA受體可通過抑制炎癥反應有效減輕高氧所致的急性肺損傷[5]，這表明NMDA受體過度激活在肺損傷的發生發展中可能起重要作用。

本實驗旨在觀察SIRT1在NMDA受體激活引起的肺上皮細胞損傷中的保護作用，為治療相關肺部疾病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠肺上皮細胞(MLE-12)購買于美國 ATCC 細胞庫；細胞培養基及胎牛血清(Gibco)；白藜蘆醇(RSV)及NMDA(Sigma)；LDH測定試劑盒(南京建成公司)；CCK-8測定試劑盒(碧云天生物公司)；ELISA試劑盒(武漢華美公司)；SIRT1多克隆抗體及二抗(博士德)；其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 分組：將肺上皮細胞MLE-12放置于5%CO2，37℃的細胞培養箱中進行培養，細胞生長達70%～80%密度時進行消化傳代。將細胞接種到細胞培養板中，采用NMDA損傷細胞建模，SIRT1激動劑RSV(DMSO溶解)進行干預。分組如下：(1)Con組(正常對照組，加入等體積DMSO)；(2)NMDA組(加入500μM NMDA處理)；(3)NMDA+RSV(加入500μM NMDA及10μM RSV共處理)；(4)RSV(加入10μM RSV處理)。各組樣本數為6，加入處理因素后繼續孵育24h。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞活力：調整肺泡上皮細胞MLE-12細胞懸液濃度為1×105個/ml，加入96孔板內，當細胞培養板內細胞融合度達到50%～60%時，即可開始進行藥物處理。24h后，每孔內加入含CCK-8溶液 20μl，混勻后繼續培養1h后，用多功能酶標儀測定 450nm 處的吸光度。

1.2.3 細胞培養液中LDH活性檢測：取細胞培養液，按照試劑盒說明書進行操作，用多功能酶標儀測定450nm處的吸光度，根據標準品活力計算樣本中LDH活性。

1.2.4 ELISA檢測細胞培養液中TNF-α、IL-6水平：收集細胞上清液，采用ELISA方法測定細胞培養液中TNF-α、IL-6含量，嚴格按照試劑盒說明書進行測定，酶標儀450nm波長測定吸光度，繪制標準曲線后計算各組TNF-α、IL-6濃度。

1.2.5 Western Blot檢測SIRT1表達：藥物處理結束后，肺上皮細胞用預冷RIPA細胞冰上裂解, 于4℃、12 000r/min條件下離心10min, 吸取上清, 用BCA法濃度樣本蛋白含量。加入蛋白上樣緩沖液，煮沸5min進行蛋白變性。取5μg蛋白上樣量, 在12%聚丙烯酰胺凝膠電泳2h, 再電轉移到活化的PVDF膜上, 室溫下封閉2h，加入一抗于4℃冰箱中過夜。次日用TBST緩沖液洗凈一抗, 再用含辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2h, TBST緩沖液洗凈二抗, 最后用ECL發光劑進行檢測, 曝光、顯影。GAPDH為蛋白內參。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件對數據進行統計學分析。計量資料以Mean±SEM表示，多組間均數比較采用析因分析(one-way ANOVA)，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RSV對NMDA所致細胞活力的影響 采用CCK8檢測各組細胞活力變化。結果顯示，與正常對照組(Con)比較，NMDA組細胞活力下降(P<0.01)。與NMDA組比較，NMDA+RSV組細胞活力較NMDA組增加(P<0.05)，單獨RSV組與對照組比較沒有明顯差別。見圖1。

圖1 RSV對NMDA誘導的細胞活力的影響

注：**與Con組比較，P<0.01;#與NMDA組比較，P<0.05。

2.2 RSV對細胞培養液中LDH活性的影響 正常情況下，LDH廣泛分布于機體各個組織細胞的細胞漿中,當細胞受到刺激出現損傷，細胞膜通透性增加時，LDH釋放進入組織液中。與正常對照組(Con)比較，NMDA組培養液中LDH活性明顯增加(P<0.01)。與NMDA組比較，NMDA+ RSV組LDH活性較NMDA組降低(P<0.01)。單獨RSV組與對照組比較沒有明顯差別。見圖2。

圖2 RSV對NMDA誘導的細胞LDH釋放的影響

注：**與Con組比較，P<0.01;##與NMDA組比較，P<0.01。

2.3 RSV對細胞培養液中TNF-α，IL-6含量的影響 與正常對照組(Con)比較，NMDA組培養液中TNF-α、IL-6含量明顯增加(P<0.01)。與NMDA組比較，NMDA+ RSV組TNF-α、IL-6含量較NMDA組降低(P<0.05)。單獨RSV組與對照組比較沒有統計學差別。見圖3。

2.4 各組細胞中SIRT1蛋白的表達比較 采用Western Blot檢測各組SIRT1表達水平，結果顯示：與正常對照組(Con)比較，NMDA處理組SIRT1蛋白水平低于對照組(P<0.05)，而NMDA+ RSV組SIRT1蛋白表達水平較NMDA組增加(P<0.05)。單獨RSV組與對照組比較沒有統計學差別。見圖4。

圖3 RSV對NMDA誘導的細胞炎癥因子含量的影響

注：A：TNF-α含量；B：IL-6含量。**與Con組比較，P<0.01;#與NMDA組比較，P<0.05。

圖4 RSV對NMDA誘導的細胞SIRT1蛋白表達的影響

注：*與Con組比較，P<0.05;#與NMDA組比較，P<0.05。

3 討論

興奮性神經遞質谷氨酸(Glu)在中樞神經系統具有重要作用，其作用主要通過NMDA受體所介導。但是，NMDA受體的過度激活會導致興奮性毒性引起細胞壞死或凋亡。據報道，外周肺組織同樣也存在NMDA受體，并參與急性肺損傷和肺泡炎癥反應。高濃度NMDA(1mM)可引起離體大鼠肺組織水腫[6]。腹腔注射NMDA可引起小鼠急性肺損傷，激活NMDA受體能夠上調肺泡巨噬細胞炎性因子TNF-α、IL-6的表達并促進其分泌[7]。肺上皮細胞是肺部抵御損傷的一道防線，肺上皮細胞損傷是急性肺損傷的一個重要的發病機制。肺損傷發病過程中，肺部炎性反應激活，多種炎性因子大量釋放，導致肺上皮屏障破壞。本研究結果表明，500μM NMDA 處理肺上皮細胞MLE-12,可引起細胞活力下降，細胞培養液中LDH 活性升高，同時細胞培養液中炎性因子TNF-α、IL-1β 含量增多，提示成功構建了NMDA誘導的肺泡上皮細胞損傷模型。

核定位的SIRT1其能參與細胞去乙酰化, 可通過多條信號通路參與機體代謝, 調控細胞分化、增殖、凋亡及抑制炎癥等[8]。研究指出, 在炎癥反應中, SIRT1通過降低NF-κB p65的乙酰化水平, 從而抑制其對于下游炎癥因子的轉錄[9]。炎癥因子的大量合成與釋放是急性肺損傷的重要特征及病理改變之一，上皮細胞在受到外來刺激時可大量合成并分泌TNF-α，后者可刺激鄰近細胞產生大量的趨化因子，并介導炎癥反應發生。SIRT1具有抗炎并抑制細胞間黏附分子表達的作用, 當炎性反應途徑激活轉錄因子NF-κB, 刺激線粒體產生大量氧自由基, 而SIRT1則通過抑制其與NF-κB啟動子的結合, 從而干擾NF-κB信號轉導，最終起到抗炎作用[10]。文獻報道，SIRT1是急性肺損傷的潛在治療靶點，熊果酸通過上調SIRT1的表達拮抗NF-κB 介導的炎癥反應，顯示出強大的抗炎作用[11]。白藜蘆醇(RSV)是目前較強的激活SIRT1的植物化合物。文獻報道，RSV上調肺泡上皮細胞中SIRT1的表達，減少ROS的產生從而減輕高氧所致肺損傷[12]。本研究通過加入RSV觀察細胞炎癥損傷的改變。結果顯示，500μM NMDA處理下調MLE-12細胞SIRT1的蛋白表達。同NMDA組比較，NMDA+ RSV組MLE-12細胞損傷程度低，活力增加，炎性因子TNF-α、IL-6含量降低且SIRT1的蛋白表達增加。結果提示炎性反應降低與SIRT1表達上調有關。實驗的結果表明，SIRT1的激活減輕了NMDA誘導的肺泡上皮細胞損傷的炎癥反應。

綜上所述，在NMDA誘導的肺泡上皮細胞損傷中，激活SIRT1可降低培養液中炎癥因子TNF-α和IL-6水平，減輕NMDA誘導的細胞損傷，具有明顯的細胞保護作用，該研究可為NMDA誘導的肺損傷治療提供新的理論及實驗支持。