乳清蛋白/矢車菊素-3-O-葡萄糖苷納米粒的制備

錢 柳，米亞妮，陳 雷，滕 慧

（福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建 福州 350002）

花色苷由花青素和各種糖以糖苷鍵結(jié)合而成，主要分為天竺葵色素、矢車菊素、飛燕草色素、芍藥色素、牽牛色素和錦葵色素6大類[1-2]，其中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C3G）是自然界中分布最廣的天然色素[3]。C3G具有抗氧化、抗糖尿病、抗微生物、抗癌、保護心血管、保護神經(jīng)、保護視力等多種生理功能，能夠調(diào)節(jié)機體功能，有效預防慢性疾病的發(fā)生[4-6]。自然界中存在的C3G易受環(huán)境因素和食品加工條件影響，使其水解或開環(huán)降解，從而導致C3G的大量損失[7]，所以研究如何通過修飾C3G結(jié)構(gòu)和提高其穩(wěn)定性具有重要意義。

乳清蛋白（whey protein，WP）是從乳清中得到的球狀蛋白質(zhì)，約占牛乳總蛋白的20%，含有所有的必需氨基酸[8]，具有營養(yǎng)價值高，易消化吸收等特點[9]。WP具有凝膠性、乳化性、起泡性和涂層性[10]，研究表明，通過物理或生化手段使WP多肽鏈或氨基酸發(fā)生變化，可以引起其分子空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而改變WP的功能特性[11-12]。Schong等[13]發(fā)現(xiàn)將WP進行加熱堿化處理，并進行噴霧干燥后，可以形成穩(wěn)定的WP微球，在不同pH值條件下，粒徑會發(fā)生可逆變化。Arroyo-Maya等[14]發(fā)現(xiàn)將WP進行酸熱處理后，加入果膠組裝成生物納米顆粒，能夠有效包埋花色苷，提升花色苷的熱穩(wěn)定性，但是對其顏色穩(wěn)定性方面無明顯作用。Hu Yan等[15]研究表明熱改性WP可通過疏水相互作用或氫鍵對柑橘皮中的類黃酮物質(zhì)進行封裝保護，包埋后的類黃酮物質(zhì)在體外模擬消化中能夠?qū)崿F(xiàn)靶向釋放，大大提高其生物利用度。Chen Lei等[16]發(fā)現(xiàn)利用微囊化技術(shù)，對多酚類化合物進行封裝，可以提高酚類化合物的生物利用度。這些發(fā)現(xiàn)都表明WP可作為一種極具潛力的多酚類物質(zhì)的遞送載體，不僅提高多酚物質(zhì)的穩(wěn)定性，大幅度提高其生物利用率，而且成本低、風險小，能夠在食品加工中發(fā)揮巨大作用。

本研究利用熱改性方法構(gòu)建WP納米粒子運輸載體，通過納米粒的粒徑電位和載藥性能變化確定WP-C3G納米粒的最佳組成比例，采用透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）和傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）研究納米粒的結(jié)構(gòu)變化，探討了WPC3G納米粒在體外消化中的緩釋性和穩(wěn)定性，并進一步研究WP在貯藏中對C3G的保護作用，為花色苷在應用加工方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

C3G（≥98%）、WP（≥80%） 上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

Zetasizer Nano ZS納米粒度分析儀 英國Malvern公司；HT-7700 TEM 日本Hitachi公司；Vertex 70 FTIR儀 德國Bruker公司；1260 Infinity高效液相色譜儀美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制和復合納米粒的制備

采用Hu Yan[15]和Giroux[17]等方法進行一定改進。準確稱取WP和C3G分別溶于水溶液中配制2 mg/mL WP和2 mg/mL C3G溶液，室溫以500 r/min連續(xù)攪拌2 h，4 ℃靜置過夜后，調(diào)節(jié)WP溶液pH值為7.0，80 ℃水浴加熱30 min，5 000 r/min離心30 min后取上清液，將溶液放在4 ℃避光保存。

將C3G溶液與WP溶液分別以體積比為0∶1、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100混勻，500 r/min攪拌1 h，分別加入不同量的1 mol/L CaCl2溶液使最終Ca2+濃度為8 mmol/L，連續(xù)振蕩攪拌2 h，超聲30 min后，制得樣品1～6號納米溶液，4 ℃避光保存。

1.3.2 高效液相色譜法測定C3G含量

高效液相色譜條件：將樣品過0.2 μm有機濾膜，色譜柱為SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A為0.2%磷酸溶液，流動相B為乙腈。洗脫梯度：0～15 min，8%～20% B；15～17 min，20%～8% B；17～20 min，8% B，流速為1 mL/min。紫外檢測器的檢測波長：520 nm，進樣量：10 μL。

1.3.3 WP濃度的測定

參照BCA蛋白濃度測定試劑盒法進行測定。

1.3.4 納米粒載藥量和包埋率的測定

參考Hu Yan等[15]的方法進行一定改進。將C3G溶于水中配制與5號樣品中C3G最終質(zhì)量濃度相同的7號樣品，將樣品在12 000 r/min離心20 min，采用高效液相色譜法計算上清液中游離C3G的質(zhì)量分數(shù)。

式中：W0為7號樣品中C3G質(zhì)量分數(shù)；W1為2～6號樣品上清液中C3G質(zhì)量分數(shù)；W為2～6號樣品中WP-C3G納米粒的總質(zhì)量分數(shù)。

1.3.5 粒徑與電位的分析

將1～6號納米溶液分別用水溶液稀釋100 倍，將樣品充分振蕩搖勻，用納米粒度儀測量溶液的粒徑大小分布與電位值。

1.3.6 TEM分析

采用TEM分析1號與5號樣品形態(tài)變化，分別取一滴溶液于銅網(wǎng)上，自然晾干后，用2%磷鎢酸溶液進行染色，負染30 min后，用濾紙吸走多余染液。將銅網(wǎng)置于TEM下觀察并拍照。加速電壓為80 kV。

1.3.7 FTIR的分析

將1號和5號樣品冷凍干燥成粉末，用KBr壓片法進行FTIR分析，測定波數(shù)為500～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)設為32 次，數(shù)據(jù)用Nicolet Omnic v8.0和Origin 9.0軟件進行分析。

1.3.8 模擬體外消化分析

參考Chen Lei等[18]的方法進行一定改進。模擬胃消化：將0.125 g胃蛋白酶、0.25 g氯化鈉完全溶于250 mL水中，配制胃消化液。分別取12 mL的5號和7號樣品，加入8 mL胃液，用6 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至2.0。將混合液37 ℃水浴振蕩（200 r/min）2 h，分別在以應第0、5、30、60、90、120分鐘取樣，消化液放于-20 ℃待測。

模擬腸消化：將0.05 g胰蛋白酶、0.625 g豬膽鹽完全溶于250 mL水中，配制腸消化液。分別取5號和7號樣品的胃消化液，加入8 mL腸液，用1 mol/L NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0。將混合液37 ℃水浴振蕩（200 r/min）4 h，分別在以應第0、15、60、120、180、240分鐘取樣，用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至2.0，消化液放于-20 ℃待測。

1.3.9 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

將WP與WP-C3G消化樣品進行SDS-PAGE分析，并將消化前后的納米溶液進行對比分析。

1.3.10 C3G保留率和釋放率的測定

消化液在12 000 r/min離心10 min，取上清液。采用高效液相法測溶液中C3G質(zhì)量分數(shù)，不同時間C3G的保留率和釋放率計算公式如下：

式中：W0為上清液中C3G的質(zhì)量分數(shù)；W1為C3G消化量；W為加入的C3G總質(zhì)量分數(shù)。

1.3.11 C3G貯藏穩(wěn)定性分析

將5號和7號樣品置于4 ℃避光貯藏20 d，每隔4 d測定溶液中C3G質(zhì)量分數(shù)和顏色變化，采用pH示差法計算溶液中C3G的保留率。

式中：N為0、1、2、3……20。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗均做3 組平行，結(jié)果以 ±s表示。采用SPSS 20軟件處理數(shù)據(jù)，P＜0.05，差異顯著；運用Origin 9.0 進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米粒粒徑與電位分析

表1 樣品1～6號的粒徑大小分布及電位值Table 1 Particle size distribution, PdI and Zeta-potential of samples 1 through 6

當WP經(jīng)過熱處理后，由表1可知WP溶液粒徑為（242.42±2.31）nm＜1 μm時，可確認為納米級溶液，與Hu Yan等[15]中WP納米粒相比，樣品1具有較大的粒徑，但是其PdI值為（0.23±0.01），電位為（-24.71±1.95）mV，溶液分布更均一穩(wěn)定。樣品2中溶液粒徑為最大值（739.57±34.74）nm，其PdI值高達（0.63±0.14），電位值僅為（-7.24±0.21）mV，溶液分布集中且不穩(wěn)定，主要是因為C3G可充當多齒狀配基，作為橋聯(lián)劑使WP形成二聚體或多聚體，所以溶液中未被包埋的C3G可促使WP發(fā)生聚集以應[19]。在樣品2～5中，隨著WP體積比增加，WP-C3G納米粒的粒徑和PdI值逐漸降低，電位值則逐漸升高，表明納米溶液分布逐漸均勻且穩(wěn)定，當C3G與WP體積比為1∶80時，粒徑（275.51±3.15）nm、PdI（0.28±0.01）和電位（-16.92±1.04）mV均達到最小值，粒徑越小表示納米粒間結(jié)構(gòu)聯(lián)系更緊密[20]，而W P包埋小分子C 3 G后也可導致納米顆粒表面積增加，所以WP-C3G相比于WP納米粒子具有較大的表面積。隨著WP的比例增加，6號樣品粒徑（（300.82±9.46）nm）和電位值（（-11.01±0.00）mV）也隨之增加，而溶液分布狀態(tài)不變，可能是因為WP與C3G體積比小于臨界值，并發(fā)生相互作用導致溶液中WP產(chǎn)生一定程度的聚集。

2.2 納米粒蛋白質(zhì)量濃度、包埋率和載藥量分析

表2 1～6號樣品的蛋白質(zhì)量濃度、包埋率及載藥量Table 2 Protein concentrations, encapsulation and loading efficiencies of samples 1 through 6

如表2所示，樣品1號溶液中實際蛋白質(zhì)量濃度為（0.98±0.07）g/L，蛋白質(zhì)量濃度主要與C3G和WP的比例有關(guān)。在2～5號樣品中，納米粒的包埋率逐漸升高，而載藥量逐漸降低，其中5號樣品的包埋率最高（97.09±2.39）%，此時納米粒的載藥量為（2.43±0.05）%，而6號樣品中的包埋率和載藥量為最低值（（69.99±4.37）%、（1.41±0.07）%）。結(jié)果表明，5號納米粒中C3G的包封效果最為顯著，WP能夠有效構(gòu)建納米粒子運輸載體，此時C3G和WP最優(yōu)組合比例為1∶80。納米粒的載藥性能是包埋過程的重要特征參數(shù)，而隨著納米粒的包埋率增加，載藥量卻降低，這一結(jié)果與Jelvehgari等[21]報道一致，其中納米粒的載藥量與C3G在納米溶液中的含量有關(guān)，而WP與C3G之間的相互作用也可能影響納米粒的包埋率和載藥量，導致其包埋率和載藥量都減少。

2.3 TEM分析

圖1 WP和WP-C3G TEM圖像Fig. 1 TEM images of WP and WP-C3G

WP經(jīng)過熱處理后（圖1A、B），通過二硫鍵與氫鍵形成蛋白膜，其溶液中納米粒子都為規(guī)則的空心納米球狀，粒子呈均勻分散狀態(tài)，其中含有較大粒徑的蛋白粒子主要是因為在Ca2+的作用下，WP間產(chǎn)生聚集體。而WP與C3G結(jié)合后（圖1C、D），粒子表面明顯像是覆蓋了一層薄涂層，形成了典型的“核-殼”結(jié)構(gòu)，這表明C3G與WP分子間發(fā)生強烈的相互作用，并被其完全包埋。而納米粒徑有所降低，可能是因為C3G與WP結(jié)合形成的共價復合物粒徑小于WP的分子聚集物。樣品在TEM中的粒徑均小于納米粒度儀的測量結(jié)果，主要是因為TEM是利用普通光學成像原理，從而分析和觀察樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，而納米粒度儀是運用動態(tài)光散射法分析，根據(jù)納米粒在溶液中做布朗運動的速率測量其粒度和分布情況，其結(jié)果具有真實性和有效性[21]，所以納米粒的粒徑以納米粒度儀測量結(jié)果為準。

2.4 FTIR分析

圖2 WP和WP-C3G FTIR圖Fig. 2 FTIR spectra of WP and WP-C3G

WP的FTIR光譜可顯示不同酰胺帶，其中蛋白酰胺I譜帶為1 600～1 700 cm-1，其由C＝O拉伸引起；酰胺II譜帶為1 500～1 600 cm-1，而出現(xiàn)在小于1 548 cm-1的區(qū)域為C—N伸展和N—H彎曲導致[22-23]。如圖2所示，WP中酰胺I帶的峰值從1 645.25 cm-1移到1 643.31 cm-1，酰胺II帶的峰值從1 544.95 cm-1移到1 552.67 cm-1。酰胺I和II譜帶的變化是由于C3G與WP的C＝O、C—N和N—H基團相結(jié)合以及WP結(jié)構(gòu)中氫鍵的發(fā)生變化導致。FTIR光譜變化證實，加入C3G后，WP的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，酰胺I帶的減弱，表明WP的α-螺旋程度降低，這與He Zhiyong等[24]報道的結(jié)果一致。

圖3則對酰胺I帶中不同子峰對應的二級結(jié)構(gòu)變化進行定量分析，其中1 610～1 640 cm-1為β-折疊，1 641～1 650 cm-1為無規(guī)卷曲，1 651～1 660 cm-1為α-螺旋，1 661～1 700 cm-1為β-轉(zhuǎn)角[25]。WP結(jié)合C3G后，其二級結(jié)構(gòu)變化主要表現(xiàn)為α-螺旋從17%降至15%，β-轉(zhuǎn)角從33%降至32%，β-以向折疊從34%升至36%，無規(guī)卷曲從16%升至17%。結(jié)果與He Zhiyong等[24]通過圓二色譜對WP與C3G結(jié)合前后的二級結(jié)構(gòu)變化分析基本相同，進一步表明，與C3G結(jié)合后，WP的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，其中WP的氫鍵發(fā)生斷裂，二級結(jié)構(gòu)的氫鍵化程度發(fā)生改變，導致螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，蛋白伸展。而β-以向折疊和無規(guī)卷曲增多，則表明WP的結(jié)構(gòu)松散，其空間構(gòu)象穩(wěn)定性降低。

圖3 WP（A）和WP-C3G（B）蛋白二級結(jié)構(gòu)分析Fig. 3 Secondary structure analysis of WP (A) and WP-C3G (B)

2.5 模擬體外消化分析

2.5.1 SDS-PAGE分析

WP中的主要蛋白質(zhì)為β-乳球蛋白和α-乳白蛋白，含量分別為55%和24%，都含有大量的氨基酸[26]，而Ca2+則與這些氨基酸的游離羧基結(jié)合，形成交聯(lián)鹽橋。如圖4A所示，對照蛋白Marker，β-乳球蛋白的分子質(zhì)量約為18 kDa，α-乳白蛋白分子質(zhì)量約為14 kDa，這與Ballerini等[27]的研究基本相同，與C3G結(jié)合后，WP的分子質(zhì)量和多肽鏈無明顯變化。如圖4B所示，加入胃蛋白酶后，α-乳白蛋白迅速分解，生成小分子質(zhì)量多肽，隨著消化時間的延長，其他蛋白質(zhì)也逐漸分解，而β-乳球蛋白無明顯酶解以應，這是因為β-乳球蛋白是WP中疏水性最強的部分，其中疏水性氨基酸在多肽鏈中易造成空間位阻，降低酶解以應速率[28]。而β-乳球蛋白對胰蛋白酶的極其敏感，由圖4C所示，胃消化液加入胰蛋白酶后，β-乳球蛋白迅速酶解，也表明WP在人體內(nèi)能較易被消化吸收。但經(jīng)過胃腸模擬消化后，WP的分解過程與C3G結(jié)合前后并無明顯變化。

圖4 WP和WP-C3G的SDS-PAGE圖譜Fig. 4 SDS-PAGE patterns of WP and WP-C3G

2.5.2 C3G保留率分析

圖5 WP-C3G和C3G模擬體外消化中C3G的保留率Fig. 5 Retention rates of C3G and WP-C3G during in vitro digestion

由圖5A所知，在模擬胃消化環(huán)境中，C3G酶解速率極低，消化2 h后保留率依然有（96.4±0.2）%，而WPC3G在消化開始5 min后就出現(xiàn)緩慢酶解趨勢，消化2 h后保留率為（86.25±0.81）%。如圖5B所示，加入胰蛋白酶后，C3G出現(xiàn)大量降解，僅有（28.21±0.33）%殘留，其降解率高達（62.09±0.53）%，在4 h酶解后，最終剩余（9.14±1.32）%。而WP-C3G則保持一定的下降趨勢進行酶解，加入胰蛋白酶后，有（75.59±0.77）% C3G殘留，降解率僅為（10.80±0.01）%，與未結(jié)合WP的C3G相比，降解率降低（51.34±0.52）%，其降解程度有明顯改善，消化4 h后，最終消化液中還剩（31.43±2.40）% C3G。研究表明，C3G在酸性模擬胃消化環(huán)境中，中性條件下的花色苷醌式堿轉(zhuǎn)化為黃烊鹽陽離子，幾乎不發(fā)生降解，而在進入中性模擬腸消化環(huán)境中，C3G的不穩(wěn)定性導致迅速分解[29]，其降解速率大于消化速率，使其生物利用度極低。C3G在結(jié)合WP后，由于α-乳白蛋白對于胃蛋白酶的敏感性，在模擬胃消化環(huán)境中，包裹了C3G的α-乳白蛋白迅速酶解，部分C3G也隨之消化分解，而進入到腸模擬消化環(huán)境中，由于WP在堿性條件下并不會迅速分解，其中的C3G保持一定的速率逐漸被消化分解，進一步證明WP納米粒子可將C3G進行定向運輸，提高了C3G的生物利用度。

2.5.3 C3G釋放率分析

圖6 WP-C3G模擬體外消化中C3G釋放率Fig. 6 Release rate of C3G from WP-C3G during in vitro digestion

如圖6所示，在加入胃蛋白酶30 min后，C3G釋放率達到（10.57±1.72）%，消化2 h后，釋放率為（18.02±1.01）%。在腸模擬環(huán)境中，C3G釋放率顯著提高，在消化1～2 h時，釋放速率最快，而2～3 h時，釋放速率最低，消化4 h后，C3G釋放率達到（87.25±3.72）%。結(jié)果顯示，α-乳白蛋白會在加入胃蛋白酶30 min后大量酶解，隨后C3G緩慢釋放，而在模擬腸液中，由于胰蛋白酶的酶解作用，C3G被大量釋放，消化4 h后，釋放率提高69%，顯然模擬腸消化環(huán)境是C3G被釋放的主要場所，而且WP-C3G納米粒在體外模擬消化后的C3G釋放率遠高于Flores等[30]的研究結(jié)果，這說明WP納米粒子對于C3G有很好的緩釋性。WP-C3G中的C3G濃度在模擬腸液中是呈現(xiàn)動態(tài)變化趨勢，一方面WP酶解釋放C3G，另一方面C3G在中性環(huán)境下不斷降解，當C3G釋放率大于降解率時，消化液中C3G濃度升高；C3G釋放率小于降解率時，消化液中C3G濃度降低，所以模擬腸胃消化后的WP-C3G中的C3G濃度高于未結(jié)合WP的C3G中的含量，而實驗結(jié)果也證明WP對于C3G能起到很好的緩釋包埋作用。

2.6 C3G貯藏穩(wěn)定性分析

圖7 WP和 WP-C3G貯藏20 d內(nèi)C3G含量變化Fig. 7 Degradation rates of free C3G and WP-C3G during 20 days of storage

如圖7所示，在貯藏0～8 d時，C3G的降解速率最大，其中第8天時，WP-C3G的降解率為28%，C3G的降解率為38%，之后C3G的降解速率明顯降低，WP-C3G的降解速率約為0.7%，而未結(jié)合WP的C3G的降解速率為1.3%。在第8～12天內(nèi)，C3G溶液以1%的速率降解，C3G溶液在貯藏20 d后，最終C3G保留率為（42.62±2.33）%，而WP-C3G中的保留率為（64.14±1.70）%，比未結(jié)合WP的C3G中的C3G保留率提高了1.9 倍。加入Ca2+可以在蛋白質(zhì)分子間發(fā)生離子結(jié)合以應，由于Ca2+具有較高的離子強度，也可有效的降低蛋白質(zhì)單體之間的靜電排斥，從而促進蛋白質(zhì)與單體之間的聚合，使C3G與WP通過疏水相互作用結(jié)合形成低孔隙的致密結(jié)構(gòu)，減慢氧氣向顆粒中的擴散，并減緩C3G在中性條件下的降解速率[31]。結(jié)果表明WP可以對C3G起到顯著保護作用，能夠有效降低C3G發(fā)生降解以應。

3 結(jié) 論

經(jīng)過熱處理變性的WP，在中性條件下加入金屬離子Ca2+形成納米粒子，納米粒子能與C3G結(jié)合形成生物聚合性復合物，并顯著提高C3G的穩(wěn)定性。通過納米粒度儀研究WP的納米直徑分布、電位值和載藥性能變化，確定C3G與WP的最優(yōu)結(jié)合體積比為1∶80。TEM和FTIR研究結(jié)果表明WP與C3G結(jié)合后，其納米顆粒大小和蛋白二級結(jié)構(gòu)都會發(fā)生改變。體外模擬消化研究表明，C3G與WP結(jié)合后，C3G在腸消化環(huán)境中，其降解速率明顯降低，由于WP易被人體消化吸收，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)C3G胃腸道靶向釋放，還可以提高C3G在人體內(nèi)的消化利用率。在貯藏性能方面，WP-C3G在貯藏時的損失率較低，C3G的降解速率縮短，貨架期延長。研究表明，WP可以降低C3G在食品加工、運輸和消化吸收中降解和損失，是一種極具潛力的新型納米材料。