沙棘果油棕櫚油酸提取物的富集及改善胰島素抵抗活性

高 山，王嘉佳，胡高爽

（河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018）

棕櫚油酸是一種16碳的單不飽和脂肪酸，雙鍵位于碳端的第7個碳原子上（16∶1 n-7）[1]。棕櫚油酸難溶于水，易溶于堿溶液和乙醚、氯仿、正己烷、乙酸乙酯等有機溶液，在常溫下為無色透明液體，且具有較好的穩(wěn)定性[2]。已有研究表明棕櫚油酸可以緩解多種代謝疾病如肥胖、高血脂、高血糖和炎癥等[3-9]。鑒于其良好的穩(wěn)定性和調(diào)控代謝能力，開發(fā)棕櫚油酸產(chǎn)品有很好的經(jīng)濟價值。目前，棕櫚油酸主要來源于魚油等海產(chǎn)品。但由于國際上禁捕鯨魚和漁業(yè)資源匱乏，棕櫚油酸來源受到限制，難以滿足市場的需求[1]。因此，尋找富含棕櫚油酸的植物并加以提取可以較好的彌補棕櫚油酸產(chǎn)量的不足。Badami等[3]通過研究多種植物的脂肪酸組成，發(fā)現(xiàn)澳洲堅果籽油中棕櫚油酸含量較高，約為30%。昆士蘭果油和沙棘果油中含量也很多，分別在17%和30%左右[2]。有報道貓兒屎（Decaisnea insignis）籽油中棕櫚油酸的質(zhì)量分數(shù)可達55.9%，以及植物貓爪（Dolichandra unguis）中其質(zhì)量分數(shù)約64%[1]。在這些植物中，沙棘在我國分布最廣，最具開發(fā)潛力。沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）是我國西部地區(qū)最具代表性的經(jīng)濟作物之一，具有極好的抗逆性，被廣泛應用于防風固沙和防治水土流失[5]。以沙棘果油為原材料提取棕櫚油酸可以拓展棕櫚油酸的來源，也為沙棘的高值化利用提供參考。

目前關于沙棘果油棕櫚油酸提取方法的報道較少，奇拉達等[10]應用CO2超臨界萃取法從沙棘果油中提取棕櫚油酸，產(chǎn)物中棕櫚油酸質(zhì)量分數(shù)可達55.24%。張澤生等[11]應用分子蒸餾法富集沙棘果油中的棕櫚油酸，其最高純度達到51.9%。本研究在上述背景下以沙棘果油為原料，建立了一種高效的沙棘果油中棕櫚油酸的提取方法-尿素包埋和分子蒸餾復合法，大大提高了沙棘果油中棕櫚油酸的提取效率。此外，已有研究表明，棕櫚油酸具有干預胰島素抵抗的效果。Kurotani等[12]以高魚類飲食的日本人為研究對象，研究了多種脂肪酸（包括硬脂酸、棕櫚油酸和亞麻油酸等）對東方人體質(zhì)的2型糖尿病胰島素抗性的影響，結果表明血清中高水平的硬脂酸、棕櫚油酸和亞麻油酸，以及低水平的血清膽固醇酯，都會減輕胰島素抵抗，緩解糖尿病癥狀。Souza等[9]研究了棕櫚油酸對α亞型過氧化物酶體增殖劑激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors-α，PPAR-α）代謝途徑的影響，發(fā)現(xiàn)棕櫚油酸可以通過影響PPAR-α關鍵蛋白減輕胰島素抗性。Bergman等[13]對1型糖尿病患者的脂肪細胞和血液進行研究，發(fā)現(xiàn)棕櫚油酸可以影響多種血糖代謝關鍵酶類，進而調(diào)節(jié)患者的胰島素分泌。然而，對棕櫚油酸降血糖功能性的評價還不全面，尤其是對富含棕櫚油酸的天然產(chǎn)物的降糖功能性評價還少有研究。本研究對沙棘果油提取物在細胞水平緩解胰島素抵抗的功能進行評價，初步探索其在降糖功能產(chǎn)品中的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘果油由內(nèi)蒙古鄂爾多斯高原圣果公司提供，是將沙棘果汁加工過程中分離出的沙棘果毛油，通過去雜、脫膠、脫酸、脫水、脫色、脫過氧化物等工序制得。所采用的沙棘品種為肋果沙棘，其中棕櫚油酸質(zhì)量分數(shù)約為30%。脂肪酸甲酯標準品 美國Sigma公司；氫氧化鉀、95%乙醇、無水硫酸銅、硫酸、鹽酸、乙醚、石油醚、正己烷等均為分析純。

1.2 儀器與設備

7890A氣相色譜儀 安捷倫科技（中國）有限公司；RE3000A型旋轉蒸發(fā)器、SHZ-III循環(huán)水真空泵 亞榮生化儀器廠；KDL-1短程分子蒸餾器 德國UIC公司。

1.3 方法

1.3.1 沙棘果油的皂化和酸化

沙棘果油的酸價較高，需進行皂化和酸化處理[11]，工藝條件如下：取適量沙棘果油樣品，配制成沙棘果油與95%乙醇料液比1∶2（g/mL）和沙棘果油與與KOH質(zhì)量比1.1∶1混合溶液并置于平底燒瓶中。將燒瓶置于80 ℃水浴中回流以應2 h。然后，加適量蒸餾水，旋轉蒸發(fā)回收混合體系中的乙醇。加入6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)混合液至pH 2～3，將混合液轉移至分液漏斗，靜置待其分層。取上層有機層，用5% NaCl溶液洗滌有機層至中性，并使用無水硫酸鈉對所得油狀物進行干燥；抽濾除去硫酸鈉后，得到沙棘果油混合脂肪酸[14-16]。

1.3.2 尿素包埋-分子蒸餾復合法提取沙棘果油中的棕櫚油酸

1.3.2.1 尿素包埋法

尿素和95%乙醇按一定比例混合，在一定溫度下攪拌回流，待尿素全部溶解后，將一定量的游離脂肪酸加入體系，繼續(xù)攪拌加熱，直到混合體系完全澄清。此后，室溫條件下將混合體系包合結晶一定時間后，迅速抽濾；濾液部分經(jīng)由旋轉蒸發(fā)器除去乙醇，采用正己烷萃取分離油層，置于分液漏斗中待其分層，取正己烷層旋轉蒸發(fā)回收正己烷，剩余油狀物即為目標產(chǎn)物[17-20]。本研究采用單因素試驗對尿素包埋過程中不同包埋時間（6、12、18、24、30 h），不同尿素與底物比（1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1（g/g））和不同的溶劑與尿素比（1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1（mL/g））等因素的最優(yōu)區(qū)間進行篩選，并通過響應面設計對工藝參數(shù)進行優(yōu)化以得到最佳工藝條件。

1.3.2.2 分子蒸餾法

經(jīng)過尿素包埋法后，大分子質(zhì)量的長鏈多不飽和脂肪酸成為影響棕櫚油酸純度的主要雜質(zhì)。因此可以采用分子蒸餾法進一步分離不同分子質(zhì)量的脂肪酸分子。同理，本研究采用單因素試驗對分子蒸餾過程中蒸餾溫度（90、100、110、120、130 ℃）、轉子轉速（100、120、140、160、180 r/min）和進料速率（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min）等因素的最優(yōu)區(qū)間進行篩選，并通過響應面設計對工藝參數(shù)進行優(yōu)化得到最優(yōu)工藝條件。

1.3.3 氣相色譜分析

1.3.3.1 游離脂肪酸的甲酯化

脂肪酸的沸點較高，在進行氣相色譜法測定時對器材的要求較高，而且高溫下容易導致脂肪酸氧化裂解，在分析過程中出現(xiàn)損失，影響分析結果。因此在進行氣相分析之前，需要對游離脂肪酸進行甲酯化處理，以降低沸點，降低檢測中的損失，提高穩(wěn)定性[21-24]。具體操作過程如下：

取200 μL游離脂肪酸樣品和2 mL 硫酸-甲醇溶液（4 mL硫酸溶于甲醇中，用甲醇定容至100 mL）置于10 mL具塞試管中充分混合。將此體系于75 ℃水浴中加熱1 h，使其充分甲酯化。隨后，加入2 mL正己烷以及5 mL蒸餾水，充分混勻萃取其中的甲酯化脂肪酸，無水硫酸鈉干燥有機層，過0.22 μmol/L有機濾膜，貯存于樣品瓶中待測。

1.3.3.2 氣相色譜條件

氣相色譜柱：HP-88（100 m×0.25 mm，0.2 μm）；進樣口溫度250 ℃；檢測器溫度270 ℃；流速1 mL/min；分流比30∶1；進樣量5 μL；升溫程序：柱溫首先設置為140 ℃，之后以5 ℃/min的速率升溫至200 ℃，保持1 min之后再以2 ℃/min的速率升溫至230 ℃；氮氣流量25 mL/min，氫氣和空氣的流量分別為40 mL/min和450 mL/min。

1.3.4 沙棘棕櫚油酸提取物改善胰島素抵抗活性分析

實驗中HepG2細胞采用標準細胞培養(yǎng)條件（5%質(zhì)量分數(shù)的CO2和37 ℃）進行培養(yǎng)。所使用的培養(yǎng)基配方為89% DMEM高糖培養(yǎng)液、10%滅活的胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素混合溶液。

隨后對胰島素作用濃度和時間進行優(yōu)化。首先將HepG2細胞轉移至96 孔板中，細胞貼壁后將培養(yǎng)基更換為含有不同濃度胰島素（10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L）的無血清培養(yǎng)基，并設立正常對照組。培養(yǎng)一定時間后，將培養(yǎng)基更換為無酚紅無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。檢測各實驗孔葡萄糖含量，并以無細胞培養(yǎng)液的葡萄糖含量為參照計算葡萄糖消耗量。葡萄糖消耗量最小組所對應的胰島素濃度即為最佳作用濃度。同理對作用時間進行優(yōu)化，待細胞貼壁后將培養(yǎng)基更換為含有最佳濃度胰島素的無血清培養(yǎng)液，分別處理24、36、48 h。后更換無酚紅無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。測定各組葡萄糖消耗量，葡萄糖消耗量最小組對應的時間即為最佳作用時間。預實驗結果表明，最佳作用濃度為10-6mol/L，最佳作用時間為36 h。

以最佳條件建立胰島素抵抗模型，設置正常組（不進行胰島素建模）、模型組（經(jīng)過胰島素建模不使用藥物處理）和劑量組（經(jīng)不同濃度沙棘棕櫚油酸提取物處理，所設劑量分別為400、200、100、50 μmol/L）。藥物處理24 h，檢測各孔葡萄糖消耗量，評價沙棘棕櫚油酸提取物改善胰島素抵抗的功能機制。另外，收集處理后的各組細胞，使用糖原測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）對不同組細胞的糖原含量進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件和Excel 2013軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)均用 ±s表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 尿素包埋-分子蒸餾復合法工藝優(yōu)化

2.1.1 尿素包埋法

尿素具有特殊的空間結構，在結晶過程中能夠形成一定空間體積的腔體，包合空間體積較小的飽和脂肪酸，并形成較為穩(wěn)定的結晶，從液體中析出，而不易被尿素包裹的部分留在液體中[25]。本研究以沙棘果油皂化得到的沙棘果油混合脂肪酸為原材料，采用尿素包埋法分離沙棘果油混合脂肪酸中空間體積較小的飽和脂肪酸，提高棕櫚油酸的純度[26]。

通過單因素試驗先對尿素包埋過程中包埋時間、尿素與底物比例和溶劑與尿素比例等因素的最優(yōu)區(qū)間進行篩選。以產(chǎn)品得率（所得沙棘果油提取物與原料的重量比）和棕櫚油酸含量（所得沙棘果油提取物中含有棕櫚油酸的量）兩個響應值衡量提取效果。如圖1所示，時間會影響結晶狀態(tài)，尿素會首先形成大塊結晶，再形成小塊細碎結晶，最后形成結塊。不同的結晶狀態(tài)會影響抽濾時所得溶液的體積，從而影響產(chǎn)品得率。本實驗中，在第12小時產(chǎn)品得率和棕櫚油酸含量達到最高。尿素與底物比例影響包埋過程中包埋物的數(shù)量，少量的尿素不能完成飽和脂肪酸的包埋，使得產(chǎn)品中含有飽和脂肪酸殘留物；而過量的尿素除了會包埋飽和脂肪酸外還會包埋一定量的目標產(chǎn)物棕櫚油酸，影響產(chǎn)物的棕櫚油酸含量和產(chǎn)品的產(chǎn)率。本實驗中，得率先上升后下降，在尿素與底物比為2∶1時達到最大，而棕櫚油酸含量在尿素與底物比2.5∶1時達到最大。溶劑與尿素比例影響尿素的溶解程度，溶劑過少會導致尿素溶解不充分，也會導致尿素析出速率的增加。另外，溶劑量過少也會使得操作中油脂更容易粘于容器壁上，導致得率下降。本實驗中，溶劑與尿素比為4∶1時產(chǎn)品得率達到拐點，而棕櫚油酸含量變化不大。

圖1 尿素包埋時間（A）、尿素與底物比（B）和溶劑與尿素比（C）對提取效率的影響Fig. 1 Effects of reaction time (A), urea to substrate ratio (B) and solvent to urea ratio (C) on extraction efficiency

在單因素試驗的基礎上，選取尿素與底物比、溶劑與尿素比和包埋時間為自變量，以棕櫚油酸得率為響應值，根據(jù)Box-Behnken試驗原理，設計3因素3水平響應面分析試驗。采用Design-Expert設計軟件進行響應面試驗設計，并對結果進行方差分析和響應曲面分析，見表1。

根據(jù)實驗設計結果，采用Design-Expert預測模型，得到尿素包埋工藝對產(chǎn)品得率影響的多項式模型（1）和尿素包埋工藝對棕櫚油酸質(zhì)量分數(shù)影響的多項式模型（2）如下：

表1 尿素包埋工藝的響應面試驗設計及結果Table 1 Box-Behnken design in terms of coded and experimental data with response variables

由表2可知，模型（1）和模型（2）的R2值分別為0.98和0.96，值為0.96和0.92，均趨近于1，這表明模型的適應性良好，非常擬合實驗設計。另外，模型的P值均小于0.01，表明模型非常顯著，可以進行本設計的優(yōu)化。而兩個模型的失擬項均不顯著（P＞0.05），表明大部分的實驗結果都可以擬合多項式。在式（1）中A、B、C、AB、A2、B2和C2系數(shù)較大，對響應值的影響大，說明3 個因素均對尿素包埋產(chǎn)物的得率有顯著影響。在式（2）中A、B、C和A2系數(shù)較大，這表明3 個因素中包埋時間對棕櫚油酸含量的影響相對較大[27-28]。

應用本多項式模型對最優(yōu)工藝組合進行預測，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品得率最大化時的工藝條件為尿素與底物比1.78∶1（g/g）、溶劑與尿素比4.44∶1（mL/g）、尿素包埋時間12.53 h，預測的產(chǎn)品得率為57.43%。最大化棕櫚油酸含量的最佳工藝條件為尿素與底物比2.47∶1（g/g）、溶劑與尿素比3.16∶1（mL/g）、尿素包埋時間12.93 h，預測的棕櫚油酸質(zhì)量分數(shù)為58.52%。綜合考慮產(chǎn)品得率和棕櫚油酸含量，優(yōu)化得到的最佳生產(chǎn)工藝為尿素與底物比1.98∶1（g/g）、溶劑與尿素比4.03∶1（mL/g）、尿素包埋時間12.15 h，優(yōu)化得到的產(chǎn)品得率為56.71%、棕櫚油酸質(zhì)量分數(shù)為57.04%。

如圖2所示，尿素與底物比的降低、溶劑與尿素比的升高和尿素包埋時間的減短，使得產(chǎn)品得率得到增加。尿素包埋時間12 h以上、尿素與底物比2.5∶1（g/g）、溶劑與尿素比4∶1（mL/g）條件下，棕櫚油酸含量達到最大。這可能是因為隨著尿素與底物比的增加，越來越多的飽和脂肪酸被移除。與此同時，單不飽和脂肪酸包括目標產(chǎn)物棕櫚油酸也被去除。因此，尿素與底物比升高使得產(chǎn)品產(chǎn)量上升，棕櫚油酸含量下降；而包埋過程在12 h左右完全結束，所以在12 h后棕櫚油酸含量變化不大。

圖2 尿素包埋法不同因素對提取效率影響的響應面Fig. 2 Response surface plots showing the interactive effects of reaction time, urea-to-substrate ratio and solvent-to-urea ratio on extraction efficiency

表2 尿素包埋工藝響應面模型方差分析Table 2 Analysis of variance of the effect of urea complexation conditions on extraction efficiency

2.1.2 分子蒸餾法

經(jīng)由尿素包埋純化，所得產(chǎn)物中棕櫚油酸的含量得到較大的提高。通過檢測尿素包埋產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)其中的飽和脂肪酸基本被去除，大分子質(zhì)量的長鏈多不飽和脂肪酸成為影響棕櫚油酸純度主要雜質(zhì)。分子蒸餾是一種根據(jù)熱運動程度和分子質(zhì)量大小的不同而分離脂肪酸分子的方法。因此本研究選取分子蒸餾方法再次對尿素包埋法處理后的樣品進行純化，實驗采用KDL-1短程分子蒸餾器對沙棘果油混合脂肪酸進行分離，儀器的真空度為0.1 Pa。

圖3 蒸餾溫度（A）、轉子轉速（B）和進料速率（C）對提取效率的影響Fig. 3 Effects of distillation temperature (A), casting rate (B) and feeding rate (C) on yield and purity of POA

表3 分子蒸餾工藝的響應面試驗設計及結果Table 3 Box-Behnken design in terms of coded and experimental data with response variables

通過單因素試驗先對分子蒸餾過程中蒸餾溫度、轉子轉速和進料速率的最優(yōu)區(qū)間進行篩選。同樣以產(chǎn)品得率（所得沙棘果油提取物與原料的質(zhì)量比）和棕櫚油酸含量（所得沙棘果油提取物中含有棕櫚油酸的量）2 個響應值衡量提取效果。如圖3所示，蒸餾溫度是對分子蒸餾工藝影響最大的因素，在特定的溫度下，分子質(zhì)量小熱運動劇烈的分子具有長的分子自由程，從而實現(xiàn)與其他組分的分離。本實驗中，產(chǎn)品得率隨著溫度的上升不斷上升，這是因為溫度升高使得分子熱運動劇烈，導致得率的上升。但是，蒸餾溫度120 ℃以上時，棕櫚油酸含量急劇下降，可能是因為分子質(zhì)量相對大的物質(zhì)也被分離出來，導致棕櫚油酸相對含量下降。所以120 ℃為最適溫度。轉子轉速影響分子蒸餾過程中涂膜的效率，較高的轉速使得脂肪酸分子充分且均勻的受熱，有利于組分的溢出。本實驗中，轉子轉速達到120 r/min時，產(chǎn)品產(chǎn)率得到較大提升，所以120 r/min轉速可能達到了涂膜最大效率；而棕櫚油酸含量受轉子轉速影響非常微弱。進料速率和轉子轉速類似，影響分子蒸餾設備對原材料的利用效率。本實驗中，進料速率超過1.5 mL/min時產(chǎn)品產(chǎn)率大量下降，這是因為過高進料速率使得樣品在蒸餾設備中的停留時間簡短，很多分子來不及溢出至收集設備，導致目標產(chǎn)物不能充分分離。棕櫚油酸含量受進料速率的影響也較小。

同樣在單因素試驗的基礎上，以蒸餾溫度、轉子轉速、進料速率為自變量，以棕櫚油酸得率為響應值，根據(jù)Box-Behnken試驗原理，設計3因素3水平響應面分析試驗，對蒸餾溫度、轉子轉速和進料速率3 個條件進行進一步優(yōu)化，采用Design-Expert設計軟件進行響應面試驗規(guī)劃，并對試驗結果進行方差分析和響應曲面分析。響應面試驗設計及結果見表3。根據(jù)試驗設計結果，采用Design-Expert預測模型，得到分子蒸餾工藝對產(chǎn)品得率影響的多項式模型（3）和分子蒸餾工藝對棕櫚油酸含量影響的多項式模型（4）多項式如下：

由表4可知，模型（3）模型（4）的R2值分別為0.97和0.97，值分別為0.94和0.95，均趨近于1。同理，兩個模型的P值均小于0.01，模型的失擬項均不顯著（P＞0.05），表明模型適應性良好，可以進行本設計的優(yōu)化。在多項式（3）中A、B、A2、B2是較顯著項，對模型（3）影響最大，表明分子蒸餾溫度和轉子轉速是影響產(chǎn)品得率的最大因素。在多項式（4）中A、C、A2和C2是顯著項，這表明分子蒸餾溫度和進料速率對棕櫚油酸含量的影響最大。

表4 分子蒸餾工藝響應面模型方差分析Table 4 ANOVA of the effect of molecular distillation parameters on yield and purity of POA

響應面分析如圖4所示，得到最大化產(chǎn)品得率的工藝條件為進料速率0.91 mL/min、轉子轉速109.07 r/min、分子蒸餾溫度109.91 ℃，產(chǎn)品得率為27.89%。最大化棕櫚油酸含量的工藝條件為進料速率1.35 mL/min、轉子轉速112.16 r/min、分子蒸餾溫度92.07 ℃，棕櫚油酸質(zhì)量分數(shù)為70.57%。綜合考慮產(chǎn)品得率和棕櫚油酸含量，優(yōu)化得到的最佳生產(chǎn)工藝為進料速率0.84 mL/min、轉子轉速116.02 r/min、分子蒸餾溫度99.75 ℃，產(chǎn)品產(chǎn)率為24.67%，棕櫚油酸質(zhì)量分數(shù)為68.02%。

圖4 分子蒸餾不同因素對提取效率影響的響應面圖Fig. 4 Response surface plots showing the interactive effects of molecular distillation parameters on yield and purity of POA

2.2 預測值驗證實驗

對各優(yōu)化條件進行驗證，采用尿素與底物比2∶1（g/g）、溶劑與尿素比4∶1（mL/g）、尿素包埋時間12 h驗證尿素包埋；此條件下產(chǎn)品得率為56.90%（模型預測值為56.71%）、棕櫚油酸質(zhì)量分數(shù)為58.27%（模型預測值為57.04%）。同理對分子蒸餾進行驗證，采用條件進料速率1 mL/min、轉子轉速120 r/min、分子蒸餾溫度100 ℃，此條件下產(chǎn)品得率為26.89%（模型預測值為24.67%）、棕櫚油酸質(zhì)量分數(shù)為72.19%（模型預測值為68.02%）。所有實際檢測結果與預測值相比誤差小于5%，說明此模型優(yōu)化合理，適合應用與實際生產(chǎn)。

2.3 氣相色譜分析

為了檢測產(chǎn)品中的棕櫚油酸含量，采用氣相色譜對提取物棕櫚油酸的含量進行分析。將0.010 0、0.005 0、0.003 3、0.002 5、0.001 7 g/mL的棕櫚油酸標準溶液依次進樣。分別以棕櫚油酸溶液的峰面積、濃度分別作為橫、縱坐標繪制標準曲線，計算得出標準曲線的回歸方程為y＝4×106x-4 205.8（R2＝0.996 1）。最后測得經(jīng)尿素包埋-分子蒸餾復合法處理后產(chǎn)物中棕櫚油酸的質(zhì)量分數(shù)能夠達到70%左右，證明本研究所提出的方法能夠有效富集沙棘果油中的棕櫚油酸。

2.4 沙棘棕櫚油酸提取物改善胰島素抵抗活性研究

圖5 沙棘棕櫚油酸提取物對胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響Fig. 5 Effect of sea buckthorn palmitoleic acid extract on glycogen content of HepG2 cells with insulin resistance

采用濃度為10-6mol/L的胰島素誘導HepG2細胞24 h建立胰島素抵抗模型。如圖5所示，模型組和正常組相比葡萄糖消耗量極顯著性降低（P＜0.01），根據(jù)先前的研究[29-30]，說明胰島素抵抗誘導成功。設置正常組、模型組和劑量組。藥物處理24 h，檢測各孔葡萄糖消耗量，結果表明當沙棘棕櫚油酸提取物濃度為200 μmol/L和400 μmol/L時，培養(yǎng)液中的葡萄糖消耗量與模型組相比顯著上升（P＜0.05）。說明沙棘棕櫚油酸提取物濃度達到200 μmol/L以上時，可提高胰島素抵抗HepG2細胞的葡萄糖消耗量，表現(xiàn)出緩解胰島素抵抗的性能。

圖6 沙棘棕櫚油酸提取物對胰島素抵抗HepG2細胞糖原含量的影響Fig. 6 Effect of sea buckthorn palmitoleic acid extract on glucose level of HepG2 cells with insulin resistance

收集各組細胞，進行糖原含量測定（圖6）。結果表明，當沙棘棕櫚油酸提取物濃度為100、200、400 μmol/L時，細胞糖原含量與模型組相比顯著上升（P＜0.05）。說明沙棘棕櫚油酸提取物濃度達到100 μmol/L以上時，可顯著改善糖原合成能力，緩解胰島素抵抗，該研究結果可以為棕櫚油酸血糖調(diào)節(jié)進一步的研究提供借鑒。

3 結 論

本實驗建立了一種尿素包埋-分子蒸餾相結合的方法提取沙棘果油中的棕櫚油酸。在單因素試驗的基礎上通過響應面分析法得到最佳的提取工藝為：尿素包埋法，尿素與底物比1.98∶1（g/g）、溶劑與尿素比4.03∶1（mL/g）、尿素包埋時間12.15 h；分子蒸餾法，進料速率0.84 mL/min、轉子轉速116.02 r/min、分子蒸餾溫度99.75 ℃。在最優(yōu)工藝下的產(chǎn)品得率為26.89%（模型預測值為24.67%），產(chǎn)品中棕櫚油酸產(chǎn)品為72.19%（模型預測值為68.02%）。沙棘棕櫚油酸提取物在濃度大于200 μmol/L明顯緩解胰島素抵抗HepG2細胞的糖攝取量，在100 μmol/L時表現(xiàn)出改善糖原水平的功能。