microRNA-24作為急性動脈粥樣硬化性腦梗死進展的生物標志物研究

袁 磊 趙曉玲 王 明 劉 洋 鹿濱麒 黃鸝麗

河南省南陽市第二人民醫院神經內科 473000

腦梗死是一種主要的腦血管疾病，威脅著人類的健康和生命，具有高發病率、致殘率和死亡率[1]。找到有效的生物標志物用于急性動脈粥樣硬化性腦梗死進展的早期診斷至關重要。血清生物標志物的使用被認為是常規臨床檢查和影像數據的最有價值的輔助手段。既往研究證明炎癥標記物，如hs-CRP和IL-6與腦梗死進展相關。

miRNA是一類天然存在的非編碼短RNA，可以調節基因的表達，并發揮各種重要的生物學功能，包括細胞分化、發育、免疫應答、代謝和癌變。此前的研究表明miRNA在嚙齒動物腦梗死血液和腦細胞中表達失調[2]。有幾種miRNA，包括miR-24，miR-210和miR-223等被報道作為腦梗死的生物標志物。microRNA-24 (miR-24), 其序列為5’-UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3’，是一種內源性非編碼小RNA，其表達失調能否對急性動脈粥樣硬化性腦梗死(PCI)進展風險進行預測，或風險預測是否可靠，需要進一步的研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究為前瞻性研究。選取2018年6月—2019年5月我院神經內科收治的急性動脈粥樣硬化性腦梗死患者194例，根據有無腦梗死進展分為進展組60例和對照組134例。納入標準：(1)發病24h內就診；(2)符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2010》中急性動脈粥樣硬化性腦梗死的診斷標準[3]；(3)經頭顱MRA或CTA證實病因為動脈粥樣硬化。進展型腦梗死的診斷標準: 1周內NIHSS評分增加≥2分[3]。排除標準：(1)伴有意識障礙者；(2)存在心功能衰竭、心房顫動、風濕性心臟病等嚴重心臟疾病者。本研究經我院倫理委員會根據“赫爾辛基宣言—人體醫學研究倫理原則”批準。所有患者均提供書面知情同意書。

1.2 數據收集 收集兩組患者的基線特征、常見腦梗死高危因素。

1.3 RNA分離和定量實時PCR 在腦梗死發病24h內，在不添加凝血劑的情況下，將5ml靜脈血收集到血清分離管中。使血液自然凝結并以1 600轉/min離心5min。收集等份的血清立即冷凍，并儲存在-80℃直至分析。

根據制造商的推薦，使用Trizol Reagent(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)分離總RNA。A260nm/A280nm比率為1.9和28S/18S比率為1.8是后續PCR的最低要求。用SuperScript Ⅲ First-Strand Synthesis System(Invitrogen)逆轉錄總RNA(2μg)。Taqman定量RT-PCR用于miRNA特異性引物擴增(目錄號4427975；Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)。將反應物在96孔光學板中于95℃溫育5min，然后在95℃下進行40個循環15s和60℃下1min。在StepOne Plus實時PCR儀(Applied Biosystems)上進行PCR反應，并使用2-ΔΔCT方法計算相對表達。U6(small nuclear RNA，snRNA6)用作內部參照。

1.4 血清hsCRP和血清IL-6的濃度 檢測腦梗死發病后24h內血清hs-CRP水平。使用夾心酶聯免疫吸附(ExCell，Shanghai，China)測定血清IL-6水平，并且所有測定一式兩份進行。

1.5 統計學方法 使用SPSS20.0統計進行數據分析。符合正態分布的計量資料使用t檢驗進行分析。計數資料組間比較采用χ2檢驗。不符合正態分布的計量資料，使用Kruscal-Wallis和Mann-WhitneyU檢驗或Wilcoxon Signed Rank檢驗進行分析。通過接受者操作特征ROC曲線分析血清miRNA-24作為急性動脈粥樣硬化性腦梗死進展的預測價值。用Spearman試驗進行相關性分析。雙側P<0.05被認為存在統計學顯著差異。

2 結果

2.1 臨床基線資料比較 進展組糖尿病比例及同型半胱氨酸高于對照組(P<0.05)，兩組其他患者基線特征及常見腦梗死高危因素比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 兩組的血清miRNA-24和血清hsCRP，IL-6水平 進展組和對照組分別測定血清hs-CRP和血清IL-6。進展組與對照組比較，hs-CRP(圖1A)和血清IL-6(圖1B)顯著上調。進展組與對照組進行比較，血清中miR-24同樣顯著上調(圖1C)。越來越多的證據表明，循環miR-24可能成為急性動脈粥樣硬化性腦梗死進展的生物標志物。

2.3 血清miR-24與促炎標志物的相關性 研究結果顯示，血清miR-24表達和血清hs-CRP(r=0.523 1)(圖2A)，或IL-6(r=0.530 5)(圖2B)之間存在中度正相關。

表1 進展組和對照組基線臨床特征

圖1 進展組和對照組血清hs-CRP、IL-6及miR-24水平

2.4 血清miR-24與梗死體積、NIHSS評分的相關性 據報道血清hs-CRP水平升高與梗死體積、NIHSS評分呈正相關，本文目的是驗證血清miR-24的表達能否反映急性動脈粥樣硬化性腦梗死的嚴重程度，能否作為腦梗死進展預測結果的臨床工具。本文結果發現血清miR-24的表達與梗死體積(r= 0.519 9，圖3A)和NIHSS評分(r= 0.646 0，圖3C)均呈正相關。此外，我們根據梗死體積(>3cm3)

圖2 血清miR-24的表達與PCI患者血清hs-CRP和IL-6相關性

或NIHSS評分(>5)將患者分為兩組，本文結果發現梗死體積>3cm3(P<0.001，圖3B)或NIHSS評分>5(P<0.001，圖3D)患者血清miR-24水平顯著增加，這表明的miR-24水平較高可能代表急性動脈粥樣硬化性腦梗死病情較重，易發生進展。

圖3 血清miR-24的表達與梗死體積、NIHSS評分相關性

A & C：使用Spearman方法確定相關性。B：條形表示中位數和四分位數范圍。Mann-WhitneyU檢驗用于統計分析。D：條形表示中位數和四分位數范圍。Wilcoxon符號秩檢驗用于統計分析

2.5 血清hs-CRP、IL-6和血清miR-24聯合用于預測PCI 通過血清miR-24預測PCI的ROC曲線下面積(AUC)為0.776(95%CI:0.628～0.813，P<0.001),見圖4。為了進一步評估失調的miR-24的預測值，計算hs-CRP、IL-6和miR-24組合的ROC曲線。如表2所示，hs-CRP和miR-24的組合獲得了更高的靈敏度/特異性(AUC=0.863,95%CI:0.801～0.936，P<0.001)，比單獨的血清hs-CRP高10.4%。IL-6和miR-24的組合獲得了更高的靈敏度/特異性(AUC=0.819,95%CI:0.738～0.892，P<0.001)，其比單獨的血清IL-6高19.7%。此外，hs-CRP、IL-6和miR-24的組合獲得最高的敏感性/特異性(AUC=0.866,95%CI:0.802～0.925，P<0.001)，這與 hs-CRP和miR-24組合非常相似。

圖4 miR-24預測PCI的ROC曲線

表2 miR-24的ROC值

3 討論

最近研究發現循環miRNA是穩定的、可再生的，并且已經被提出作為診斷許多神經退行性疾病新的非侵入性生物標志物[4]。有研究表明，許多循環miRNA與神經血管完整性、功能障礙和卒中介導的炎癥相關[5-6]。盡管已報道許多循環miRNA與PCI相關，但是這些失調的miRNA是否對于PCI風險預測是可靠的，需要多研究人員進一步驗證。

miR-24是研究最多的miR之一，其在血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cell，VSMCs)的增殖、分化和表型轉換中至關重要。在心血管系統，miR-24不僅對心臟和血管的細胞分化、增殖很重要，并已被認為是血管疾病治療的新靶點[7-8]。炎癥標記物例如血清hs-CRP和IL-6在PCI被用作附加的診斷工具，因此，本研究評估了表達失調的循環miR-24和腦梗死進展、hs-CRP或IL-6的相關性。結果表明，血清miR-24與腦梗死進展及血清hs-CRP或IL-6呈正相關，可作為PCI的潛在生物標志物。此外，血清miR-24與梗死體積和NIHSS評分呈強陽性相關。因此，血清的miR-24也可以反映急性動脈粥樣硬化性腦梗死的嚴重程度，可能用作預測腦梗死進展的臨床工具。

為了提高診斷的靈敏度和特異性，總是使用多種生物標志物的組合。hs-CRP和D-二聚體的組合提高了急性期心源性栓塞的診斷準確性。較高的hs-CRP水平和脂蛋白相關的磷脂酶A2(lipoprotein-related phospholipase A2，Lp-PLA2)活性與急性動脈粥樣硬化性腦梗死更嚴重的神經損傷和更大的梗死面積顯著相關[9]。hs-CRP和同型半胱氨酸是急性動脈粥樣硬化性腦梗死進展預后和死亡率的獨立預測因子[10]。組合模型可以提供更可靠的預后評估。在本研究中，hs-CRP和miR-24的組合獲得了更高的靈敏度/特異性(AUC=0.863，P<0.001)，比單獨的血清hs-CRP高10.4%，而hs-CRP、miR-24和IL-6的組合獲得了非常相似的靈敏度/特異性(AUC=0.866，P<0.001)。因此，miR-24可能是PCI預測的潛在生物標志物。

本文結果不僅為miR-24作為PCI評估的新生物標志物提供了證據，而且進一步證實了miR-24在血管病理學中的重要作用。很多腦梗死發生、發展中的細胞變化都是由miRNA表達變化介導的，這表明miRNA表達的分析可以提高對腦梗死發病機制的認識，并發現腦梗死進展風險評估和治療的新途徑。血清miR-24升高是評估急性動脈粥樣硬化性腦梗死進展的潛在生物標志物。

本研究也存在一些局限性：首先，由于本研究的單中心和病例數較少，可能存在由未測量因素造成的殘余混雜；其次，該研究隨訪時間較短。將來需要大規模的隨機、對照試驗提供長期的臨床分析。