肺腺癌組織中CPNE1蛋白的表達及臨床意義

宋鵬濤，劉順林，劉志聰，平金良

肺癌是全球范圍內常見的惡性腫瘤，因缺乏有效的診斷標志物造成其早期診斷率低，一旦發現多數已處于晚期，導致其治療效果差，預后不良，病死率極高，5年生存率僅為15%左右。因此，尋找敏感、高效和特異性強的早期診斷標志物成為迫在眉睫的任務，這在肺癌的防治中起著至關重要的作用。

Copines蛋白家族是新近發現的一類分布廣泛、進化保守的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白[1]。最近研究表明，CPNE家族成員與腫瘤的發生、發展有關[2]。Copine1(CPNE1)是Copines家族中第一個被發現的成員，其定位于人第20號染色體上，編碼537個氨基酸[3]。但目前對該基因的研究報道非常少，而在腫瘤方面的研究更鮮有報道。本課題組前期實驗發現，CPNE1蛋白在肺腺癌組織中的表達強度明顯高于正常肺組織，本實驗應用免疫組化SP法和RT-PCR技術檢測CPNE1在肺腺癌組織和正常肺組織中的表達及其與肺癌臨床病理特征的關系，為肺癌的早期診斷和臨床預后評估奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料收集2007～2012年浙江省湖州市中心醫院病理科診斷的人肺腺癌標本186例，所有肺腺癌患者術前均未行放、化療等其他治療。其中男性96例，女性90例，年齡20～79歲，平均59歲；正常肺組織30例，其中男性20例，女性10例，年齡45～73歲，平均60歲，所有組織標本均經兩位病理科醫師證實。所有標本均按照2009年國際抗癌聯盟(AJCC)TNM分期標準進行臨床分期，其中Ⅰ+Ⅱ期101例，Ⅲ+Ⅳ期85例；分化程度：低分化94例，高+中分化92例。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 采用免疫組化SP法檢測CPNE1的表達。石蠟包埋組織4 μm厚切片，常規脫蠟，梯度乙醇(95%、85%、75%)水化，抗原修復液(0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液，pH 6.0)修復2次，PBS洗滌3次，一抗4 ℃過夜(1 ∶2 000兔抗人CPNE1)，其中陰性對照所用的一抗則用正常的羊血清，過夜后PBS洗滌，加入二抗，37 ℃，孵育時間30 min，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封固等步驟后進行觀察[4]，操作步驟嚴格按檢測試劑盒說明書進行。

結果判定與分析：CPNE1蛋白在肺腺癌組織及正常肺組織中免疫組化結果判斷標準參考Yu等[5]的方法，光鏡下觀察整個組織標本的著色范圍與著色強度。CPNE1蛋白陽性定位于細胞質及細胞膜，呈棕黃色或棕褐色顆粒。在高倍鏡下(×400)，以5個不同的視野為隨機采取對象，計算陽性細胞總數，按陽性細胞數所占的百分比(P)計算分值：陽性細胞數<10%為1分，10%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分；按照細胞染色強度計分：陰性為1分，弱陽性為2分，中等強度為3分，強陽性為4分。將兩項得分結果相乘：4分以下為(-)；4～8分為(+)；8～12分為()；12～16分為()。(～)級為高表達，屬于高表達組，(-～+)為低表達，屬于低表達組。同時根據肺腺癌患者性別、年齡、TNM分期、淋巴結轉移等臨床病理特征將186例患者進行分組，比較CPNE1蛋白表達水平在各組間存在的差異性。

1.2.2RT-PCR 采用TRIzol試劑盒從肺腺癌組織中提取總RNA進而利用Super Script Ⅲ逆轉錄酶(美國Invitrogen公司)將總RNA樣品用隨機引物逆轉錄成cDNA。設計合成引物進行RT-PCR。引物序列如下：上游5′-ACCCACTCTGCGTCCTT-3′，下游5′-TGGCGTCTTGTTGTCTATG-3′，并以ACTB mRNA作為內參，其引物序列如下：上游5′-CACAGAGC CTCGCCTTTGCC-3′，下游5′-ACCCATGCCCACCAT CACG-3′。所有反應進行3個重復，表達水平通過2-ΔΔCt法分析。

1.2.3Western blot法 分別提取20例肺癌組織和正常肺組織的總蛋白，利用SDS-PAGE變性凝膠電泳等技術進行蛋白分離，經電轉、脫脂、封閉、洗滌等步驟，再加入一抗和二抗后，進行光密度積分值分析，進而計算不同組織中的蛋白相對含量。

1.3 統計學分析利用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗法進行分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺癌組織和正常肺組織中CPNE1蛋白的表達CPNE1蛋白主要位于人肺腺癌細胞質，同時其在細胞膜中也少量存在，主要呈棕褐色(圖1)。在186例肺腺癌組織中有68例呈低表達(36.56%)，118例呈高表達(63.44%)，在30例肺正常組織中均呈低表達。

CPNE1蛋白表達在無遠處轉移組中的高表達率為58.12%，有遠處轉移組的高表達率為80.76%；CPNE1蛋白表達在Ⅰ+Ⅱ分期中的高表達率為41.58%，在Ⅲ+Ⅳ分期中的高表達率為84.71%。CPNE1表達與肺腺癌TNM分期(P<0.05)、臨床分期(P<0.05)、遠處轉移(P<0.05)相關。CPNE1與肺腺癌分期、遠處轉移有關，與患者年齡、性別、腫瘤大小等無關(表1)。

表1 肺腺癌中CPNE1的表達與臨床病理特征的相關性[n(%)]

ABC

圖1CPNE1在肺腺癌組織和正常肺組織中的表達：A.在肺腺癌組織中低表達；B.在肺腺癌組織中高表達；C.在正常肺組織中低表達，SP法

2.2 正常肺組織和肺腺癌組織中CPNE1基因表達分析對正常肺組織和肺腺癌組織中CPNE1 mRNA表達量進行檢測，結果顯示20例肺腺癌組織中CPNE1 mRNA表達量均顯著高于正常肺組織。該結果與免疫組化結果基本一致，也從另外一個角度驗證了肺腺癌組織中CPNE1的表達量高于正常肺組織(圖2)。

圖2 正常肺組織和肺腺癌組織中CPNE1基因的表達

2.3 正常肺組織和肺腺癌組織中CPNE1蛋白的差異Western blot結果顯示，20例肺腺癌組織中CPNE1蛋白含量均顯著高于正常肺組織(圖3)。該結果與免疫組化及RT-PCR結果基本一致，也從另外一個角度驗證了肺腺癌組織中CPNE1蛋白的表達量高于正常肺組織。

圖3 Western blot法檢測肺腺癌組織和正常肺組織中CPNE1蛋白的表達

3 討論

腫瘤蛋白質組學研究的重點內容之一是篩選腫瘤與正常組織細胞之間的差異表達蛋白質組，并探尋差異蛋白質的功能[6]。正常組織細胞與腫瘤組織細胞間的差異蛋白表達存在明顯差異并會隨著腫瘤的發生、發展過程的變化而變化，這些差異性變化也反應在腫瘤發生惡性特征、功能轉換、細胞凋亡分化等生物學過程[7-9]，這對于認識腫瘤的發生、發展和癌變機制，篩選尋找高度特異性、敏感性的腫瘤診斷標志物以及新的藥物作用靶點提供理論依據，對腫瘤的早期診斷、預防和治療具有重要的現實意義。本實驗采用免疫組化SP法和RT-PCR法從兩個角度驗證了CPNE1蛋白在肺腺癌組織和正常肺組織間的差異表達，結果表明肺腺癌組織CPNE1的表達量顯著高于正常肺組織，CPNE1蛋白表達與肺腺癌淋巴結轉移、臨床分期有關。CPNE1蛋白表達與肺腺癌的發生、發展及預后密切相關，有望成為肺腺癌預后評估的重要指標。

CPNE1蛋白是Copines家族中最早發現的成員，是由Creutz在研究分離草履蟲偶聯蛋白時首先發現的[10]。近年眾多研究表明，CPNE家族成員與腫瘤的發生發展、膜轉運及胞內信號傳導等相關。Kulesza等[11]發現CPNE3在非小細胞肺癌中是一種新型的腫瘤轉移促進因子，而其在乳腺腫瘤、前列腺腫瘤和卵巢腫瘤中差異蛋白質組學的結果也表明其表達量顯著高于正常組織，表明其與上述癌癥存在一定的關系。Maitra等[12]發現Copine-4與前列腺的調節和形成具有一定的相關性。Bruin等[13]在研究散發性乳腺癌雜合性缺失(loss of heterozygosity, LOH)時發現CPNE7存在于LOH中，表明CPNE7可能具有抑癌基因的作用。CPNE8是一種較晚發現的Copine家族成員，最近研究表明其在前列腺、心臟及腦組織中的表達較為常見[15]，同時，Ramsey等[14]發現其可能是急性髓性白血病癌細胞增殖的負調控因子。

雖然CPNE1是最早發現的Copines家族成員，但對其研究相對較少，而其在腫瘤方面的研究幾乎為空白。Yang等[15]在研究人類CPNE1時發現其定位于第20號染色體，編碼537個氨基酸，有多種剪切方式。Ghislat等[16]研究發現CPNE1是一種Ca2+依賴結合蛋白，其在自噬體和溶酶體以及內涵體的膜融合過程中起重要的調節作用。Ma等[17]在研究丹酚酸對心腦血管治療作用時發現，CPNE1可能是細胞骨架蛋白的重要成分，且在信號傳導途徑中發揮重要作用。

綜上所述，本實驗從不同角度驗證了CPNE1蛋白在肺腺癌組織和正常肺組織間的差異表達，并表明其與淋巴結轉移、臨床分期有關，CPNE1蛋白表達與肺腺癌的發生、發展及預后密切相關，有望成為肺腺癌預后評估的重要指標，但其具體機制仍需進一步深入探究。