血管肉瘤相關miRNAs的生物信息學預測及分析

魏院鋒，張海俊，李 麗，張 璐，金 珊，鄒 泓，賈 薇，龐麗娟

血管肉瘤是一種高度惡性的內皮細胞腫瘤，發病率較低，約占軟組織肉瘤的2%[1]。本病惡性程度高，病情進展快，早期易發生轉移，5年生存率極低[2]。目前主要治療手段是手術切除，但局部復發率高，治療效果差。因此急需尋找有效的標志物用于血管肉瘤的早期診斷和治療。microRNAs(miRNAs)是一類高度保守的長度為19～22個堿基的非編碼小RNAs，幾乎在所有疾病的病理生理過程中發揮著重要的作用。目前關于血管肉瘤的具體發病機制、特異腫瘤標志物的篩選及其治療靶點的研究較少，阻礙了血管肉瘤的診療。本實驗從基因表達數據庫(gene expression omnibus, GEO)中下載血管肉瘤及良性毛細血管瘤的miRNAs芯片數據，篩選出兩者之間差異明顯的miRNAs并進行相關生物信息學分析，為闡明miRNAs在血管肉瘤的惡性生物學行為中發揮的功能及其具體分子機制研究奠定基礎，為血管肉瘤的早期診斷、靶點研究等提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料從GEO數據庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下載血管肉瘤表達譜芯片的矩陣數據(GSE65657)，該數據包含了3例血管肉瘤患者(GSM1602577-2579，2例女性，1例男性，年齡分別為65、47、48歲)，3例毛細血管瘤患者(GSM1602580-2582，2例女性，1例男性，年齡分別為38、39、40歲)。

1.2 差異miRNAs的篩選血管肉瘤和毛細血管瘤之間的差異miRNAs篩選使用GEO在線分析工具GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)進行，篩選的條件是：P<0.05和|log fold-change|≥4，篩選出的差異表達miRNAs用R包進行聚類熱圖及火山圖繪制。

1.3 差異miRNAs的靶基因預測差異表達的miRNAs靶基因預測使用miRWalk 2.0(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/)網站進行，該網站包含miRWalk、miRanda、RNA22及Targetscan等多個miRNAs靶基因預測工具。為提高預測靶基因的準確性及降低假陽性率，選擇在列舉的這四個數據庫中均能預測到的基因被認為是靶基因。

1.4 差異miRNAs靶基因的基因本體(gene ontology, GO)功能富集分析細胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)、生物過程(biological process)是GO的三個主要方面。把目標靶基因列表提交到FunRich 3.1.3軟件(http://www.funrich.org/)中進行GO功能富集分析。

1.5 差異miRNAs靶基因的KEGG通路富集分析京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)是一個基因功能系統分析的數據庫，根據高通量分子水平信息注解生物系統的高級功能。把靶基因導入KEGG在線分析工具KOBAS 3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)中進行靶基因信號通路富集的分析，顯著富集通路的篩選標準為P<0.05和矯正后P<0.05。

1.6 差異miRNAs靶基因的蛋白相互作用分析將主要參與GO及KEGG富集分析中的靶基因導入String11.0在線分析網站(https: //string-db.org/)，參數設置為最低互作分值設置成高度可信(highest confidence: 0.9)、隱藏網絡中斷開的節點及不相關的節點。

2 結果

2.1 差異miRNAs篩選的結果按照P<0.05和|log fold-change|≥4的條件進行差異miRNAs的篩選，篩選出53個差異表達miRNAs，其中上調者51個，下調者2個(圖1)。下調的miRNAs及部分顯著上調的差異miRNAs見表1。

表1 部分差異表達的miRNAs

圖1 A.差異表達miRNAs的聚類圖；B.差異表達miRNAs的火山圖；紅色代表上調的miRNAs，綠色代表下調的miRNAs，黑色代表miRNAs變化不顯著，色鍵從綠色至紅色變化提示miRNAs表達增強

2.2 差異miRNAs靶基因預測結果為了闡明血管肉瘤中差異miRNAs的功能，使用常用的miRNAs靶基因預測網站對53個差異miRNAs進行靶基因預測，選取在4個數據庫中均能預測到的基因為靶基因，最終有6 853個基因認定為靶基因。

2.3 GO功能富集分析GO富集分析分為三大類：細胞組分、分子功能、生物過程，將6 853個靶基因輸入Funrich軟件進行GO功能富集分析。結果發現差異miRNAs的靶基因在生物過程方面顯著富集于細胞通訊、信號轉導等；細胞組分方面主要集中于內體、細胞質、細胞質膜等；分子功能方面主要涉及轉運活性、細胞黏附分子活性等(圖2)。

2.4 KEGG通路富集分析通路富集分析發現，差異表達miRNAs的靶基因顯著富集于腫瘤信號通路、代謝通路、環腺苷酸(cAMP)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、PI3K/AKT信號通路、Ras信號通路等210條通路，富集最顯著的10條通路見圖3。

圖2 差異miRNAs靶基因GO功能富集分析：A.生物過程；B.細胞組分；C.分子功能

圖3 差異表達miRNAs靶基因KEGG信號通路富集分析

2.5 miRNAs重要差異靶基因的蛋白互作網絡選取顯著性GO和顯著性KEGG信號通路及其所屬的靶基因的交集在String11.0(https://string-db.org/)在線分析網站構建蛋白互作網絡，去除不相關的節點，結果發現在差異miRNAs靶基因編碼蛋白互作網絡中，STAT3、TP53、MAPK1、SRC、PIK3R1、RAP1B、S1PR3等在網絡中具有重要地位(圖4)。

3 討論

血管肉瘤是一種高度惡性的軟組織肉瘤，預后極差。目前關于人血管肉瘤的研究大多為個案報道[3]，關于其具體的發病機制及相關治療靶點的研究較少，嚴重阻礙血管肉瘤的診療進展。本實驗從GEO數據庫中下載血管肉瘤及良性毛細血管瘤miRNAs表達譜芯片數據，利用GEO在線分析工具GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)將樣本設為血管肉瘤組及良性毛細血管瘤組，按照P<0.05和|log fold-change|≥4的條件進行篩選，篩選出53個差異表達的miRNAs，接下來運用miRNAs靶基因預測網站miRWalk 2.0(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/)對差異表達的53個miRNAs進行靶基因預測，該網站包含miRWalk、miRanda、RNA22及Targetscan等多個miRNAs靶基因預測工具。為了提高預測靶基因的準確性及降低假陽性率，選擇在列舉的這四個數據庫中均能預測到的基因被認為是靶基因，并對靶基因進行GO及KEGG富集分析，結果發現靶基因參與多個與腫瘤惡性生物學行為密切相關的生物過程、代謝途徑和信號通路。

圖4 蛋白互作網絡圖：圓圈表示靶基因對應的蛋白質，連線表示蛋白質之間相互作用，蛋白質之間的連線越多表示蛋白質越重要

篩選的53個差異表達的miRNAs中，按P值排序下調最顯著的是hsa-miR-518b，上調最顯著的是hsa-miR-137。有研究發現miR-137可通過靶向肝癌細胞中的EZH2-STAT3信號傳導途徑抑制肝癌的遷移和侵襲能力，miR-137-EZH2-STAT3可能是治療人肝細胞癌的潛在治療靶標[4]。Fasihi等[5]研究提示hsa-miR-137可調節Wnt信號通路，從而影響結直腸癌的生物學行為。Lv等[6]的研究結果表明miR-137可以通過下調GLO1的表達從而抑制黑素瘤細胞增殖。Li等[7]發現miR-137通過調節XIAP促進卵巢癌細胞的凋亡。Hu等[8]表明hsa-miR-518b的表達與膀胱癌的預后相關。Yanokura等[9]的研究結果提示hsa-miR-518b可作為子宮內膜癌的預后生物標志物。然而關于hsa-miR-518b和hsa-miR-137在血管肉瘤發生、發展過程中的功能，目前尚未見報道，仍需進一步探討。

將差異表達miRNAs的靶基因進行GO及KEGG信號通路富集分析，結果發現這些靶基因主要參與細胞通訊、信號轉導等生物學過程，主要參與cAMP信號通路、MAPK信號通路、PI3K/AKT信號通路、Ras等信號通路。有研究發現PI3K/AKT/mTOR、MAPK、Ras信號通路在腫瘤中處于異常激活狀態，并對腫瘤的侵襲、遷移等惡性生物學行為起重要的調節作用。Chen等[10]研究發現miR-27b可以靶向PI3K p110α，以抑制結直腸癌干細胞的增殖和遷移。Liu等[11]研究發現miR-21-5p可通過靶向PDCD4調節PI3K/AKT/FOXO1信號傳導通路來抑制舌鱗狀細胞癌的凋亡。Wang等[12]表明SOX9/miR-203a可以激活PI3K/AKT信號通路，從而促進食管癌的進展。在血管肉瘤組織中PI3K/AKT/mTOR通路同樣處于異常活化狀態，其可能成為血管肉瘤的治療靶點。Wada等[13]研究表明PI3K/mTOR抑制劑NVP-BEZ235可抑制血管肉瘤細胞的生長。Adachi等[14]亦發現PI3K/AKT/mTOR相關蛋白在犬血管肉瘤中高表達，以上研究結果提示PI3K/AKT/mTOR信號通路可能是血管肉瘤治療的重要靶點。Wang等[15]發現miR-1204可通過靶向ZNF418從而激活MAPK和C-Jun/AP1信號通路來促進肝癌的進展。Wang等[16]提示miR-134可通過激活PLXNA1介導的MAPK信號傳導通路阻止食管鱗狀細胞癌的發展。在血管肉瘤中，Arbiser等[17]發現磷酸化的MAPK在血管肉瘤中低表達，而在良性毛細血管瘤及化膿性肉芽腫中高表達，提示磷酸化MAPK可能與血管肉瘤的惡性程度呈負相關。同樣，Ras信號通路與多種腫瘤的惡性生物學行為也密切相關。Soleimani等[18]研究發現RAS/MAPK信號通路調控的miRNAs在結直腸癌的病程進展中發揮重要作用。Boivin-Angele等[19]在肝血管肉瘤中發現了Ras突變。以上結果提示PI3K/AKT、MAPK、Ras等信號通路可能存在交互作用共同促進了血管肉瘤的發生、發展，但其具體的機制仍待進一步研究。

應用String進一步對主要的靶基因構建蛋白互作網絡，結果發現差異miRNAs主要調控STAT3、TP53、MAPK1等關鍵靶蛋白的表達。Yang等[20]研究發現靶向NF-κB/IL-6/STAT3途徑可能為血管肉瘤的靶向治療提供理論依據。Petterino等[21]發現STAT3在犬血管肉瘤中處于高度活化狀態。Calvete等[22]報道TP53的狀態與血管肉瘤密切相關。Verbeke等[23]發現TP53在骨血管肉瘤中低表達。String網站預測的有重要作用的靶蛋白與上述研究中報道的蛋白較一致，提示這些靶蛋白可能是血管肉瘤惡性生物學進展中的關鍵蛋白。

綜上所述，本組實驗發現miRNAs的異常表達在血管肉瘤的惡性生物學行為中發揮著關鍵作用，差異表達miRNAs的主要靶基因參與許多與腫瘤惡性生物學行為相關的生物過程和信號通路，為后續進一步研究血管肉瘤發生、發展提供重要的研究依據。