四川省新型冠狀病毒相關實驗室檢測及生物安全操作專家共識

蔣 黎，劉靳波，郭曉蘭，熊大遷，許 穎，應斌武，肖代雯，黃文芳，楊正林

(1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院檢驗科，四川 成都 610072；2.西南醫科大學附屬醫院檢驗科，四川 瀘州 646000；3.川北醫學院附屬醫院檢驗科，四川 南充 63700；4.成都中醫藥大學附屬醫院檢驗科，四川 成都 610075；5.成都醫學院第一附屬醫院檢驗科，四川 成都 610500；6.四川大學華西醫院實驗醫學科，四川 成都 610041)

為加強四川省新型冠狀病毒感染的防控工作，指導省內相關醫療機構實驗室開展新型冠狀病毒相關檢驗，同時保障實驗室生物安全，依據國家衛生健康委辦公廳印發的《新型冠狀病毒感染的肺炎防控方案(第三版)》、《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南(第三版)》、《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南(第二版)》、《關于新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》和中華醫學會檢驗分會發布的《2019新型冠狀病毒相關實驗室檢驗及生物安全防護指南(試行第一版)》等文件，制訂本共識。

1 適用范圍

本指南適用于四川省醫療機構醫學實驗室開展新型冠狀病毒肺炎及疑似病例的實驗室檢驗，包括新型冠狀病毒核酸檢測、IgM/IgG抗體血清學檢測，及輔助診斷和/或病情監測所需血常規、尿常規、C反應蛋白、降鈣素原、生化指標(肝酶、心肌紅酶、腎功等)、凝血功能等項目的檢測。

2 新型冠狀病毒肺炎的病原學及流行病學特點

2019年12月底，在湖北武漢爆發了由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染引起的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)，并迅速蔓延到全國其他省市，以及境外多個國家和地區[1]。截至2020年3月，全球37個國家和地區累計報告新型冠狀病毒肺炎病例已超過八萬，死亡病例近3000，其中大約96%的病例發生在中國[2，3]。SARS-CoV-2是從人類分離的第7類冠狀病毒，具有冠狀病毒家族的典型特征，屬于β-冠狀病毒。對新型冠狀病毒的全基因組測序和分析顯示，該病毒明顯區別于SARS-CoV和MERS-CoV，而與蝙蝠SARS樣冠狀病毒 RaTG13 株全基因組親緣關系最近，同源性為 96%。冠狀病毒對紫外線和熱敏感，56 ℃ 30 min，乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效消滅病毒。氯己定不能有效滅活病毒。

新型冠狀病毒肺炎的潛伏期平均5～6天，范圍為1～14天。目前明確的傳染途徑包括呼吸道飛沫和密切接觸，相對封閉環境中長時間暴露于高濃度氣溶膠。人群普遍缺乏免疫力，幾乎人人易感。主要體征和癥狀包括發熱、干咳、乏力、咳痰、氣短、肌痛或關節痛、咽痛和頭痛。多數感染者為輕癥并可痊愈，但年齡60以上及有基礎疾病的感染者可發展為重癥肺炎及死亡。

新型冠狀病毒肺炎的實驗室表現包括，發病早期外周血白細胞總數正常或降低，淋巴細胞計數減少，部分患者出現肝酶、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酶和肌紅蛋白增高；部分危重者可見肌鈣蛋白增高。多數患者C反應蛋白(CRP)和血沉升高，降鈣素原正常。嚴重者D-二聚體升高、外周血淋巴細胞進行性減少。重型、危重型患者常有炎癥因子升高[5]。患者鼻咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物、血液、糞便等標本中可檢測出新型冠狀病毒核酸。為提高核酸陽性檢出率，建議采集下呼吸道樣本送檢。研究表明，肺和腸道組織能夠分離出新型冠狀病毒，具有傳染性[5]。患者血液和其他體液尚不能確定是否含有活病毒，但所有樣本均應按有傳染性處理。新型冠狀病毒肺炎發病早期特異性IgM抗體升高，及疾病中期到恢復期特異性IgG抗體的逐步升高。

3 實驗室安全原則

①新型冠狀病毒暫按照病原微生物危害程度分類中第二類病原微生物進行管理。②病毒分離培養、動物實驗要求生物安全三級實驗室，并須經省級衛生健康行政部門審核后報國家衛生健康委批準方可開展。③未經培養的感染性材料，如不能可靠滅活，進行臨床檢驗時，應在生物安全二級實驗室，采用生物安全三級實驗室的個人防護。

4 生物安全防護

4.1 防護用品醫用外科口罩(YY0469-2011)、醫用防護口罩(GB19083-2010)、N95(美國NIOSH42CF R84-1995，中國KN95[GB2626-2019])、全面型呼吸防護器、防護服、隔離衣、工作服、乳膠手套、醫用防護帽、護目鏡、面屏、靴套。防護用品由專人領取、發放。

4.2 生物安全防護級別①一級生物安全防護：醫用外科口罩、乳膠手套、工作服、醫用防護帽，加手衛生。②二級生物安全防護：醫用防護口罩、乳膠手套、工作服外隔離衣、醫用防護帽，加手衛生。酌情可加護目鏡。③三級生物安全防護：醫用防護口罩、雙層乳膠手套、面屏/護目鏡、工作服外防護服、醫用防護帽，靴套，加手衛生。

4.3 紫外線須定期檢測性能、完整記錄、累積不超過規定時限。每次消毒時間不少于30 min。

4.4 消毒液每天試驗前后使用 500 mg/L 有效氯的消毒液(84消毒液100倍稀釋)或75%乙醇進行桌面、臺面及地面消毒。

4.5 手衛生掌握正確地洗手方法(六步洗手法)和時機。不隨意觸摸面部皮膚、摸眼睛、挖鼻孔等。建議剪短長發，禁止飾物。

4.6 高壓滅菌廢棄物打包后，就地進行121 ℃ 15 min高壓滅菌，每次用化學指示膠帶和化學指示卡進行監測，每月用生物指示劑監測滅菌效果。

5 標本采集

5.1 采集對象新型冠狀病毒肺炎疑似/確診病例、近期有新型冠狀病毒肺炎患者暴露史人員，上呼吸道疾病患者及非典型性肺炎患者等的新型冠狀病毒感染診斷或鑒別診斷者。

5.2 采集項目①篩查和疑似病例建議申請必須的檢測項目包括血常規、全血CRP、新型冠狀病毒血清學及核酸檢測。②確診病例進行診療必要的檢測項目，為避免實驗室人員風險，盡可能少開展手工檢測項目。

5.3 采集防護①呼吸道飛沫、氣溶膠，對采集者有傳播威脅，接觸其皮膚、衣物和日常用品，有接觸傳播的風險，因此，采集者需三級生物安全防護(醫用防護口罩、雙層乳膠手套、面屏/護目鏡、防護服、醫用防護帽，靴套)。②患者要求佩戴外科口罩或其他呼吸屏障，避開患者咳嗽和呼吸道診療操作。③采集過程須兼顧安全和目標，在能夠達成目標的情況下，盡量減少接觸、盡量避免氣溶膠和飛沫產生、盡量縮短在床旁的持續時間。④患者自主完成采集時，如咳痰、糞便標本，醫師或護士交代完醫囑后即行回避。

5.4 常見采集方法①新型冠狀病毒核酸檢測的標本類型包括上呼吸道的咽拭子、鼻拭子和鼻咽抽取物，下呼吸道的深咳痰液、呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液和肺組織活檢標本。為提高呼吸道樣本的新型冠狀病毒核酸陽性檢出率，兼顧采樣的便捷性，首選深咳痰，其次鼻咽拭子，最后才是咽拭子。可根據臨床表現與采樣時間間隔進行采集。a.咽拭子：用1～2根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時擦拭雙側咽扁桃體及咽后壁，將拭子頭浸入含3 ml采樣液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。b.鼻拭子：將1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子輕輕插入鼻道內鼻腭處，停留片刻后緩慢轉動退出。取另一根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子以同樣的方法采集另一側鼻孔。上述兩根拭子浸入同一含3 ml采樣液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。c.鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用與負壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取黏液或從氣管抽取呼吸道分泌物。將收集器頭部插入鼻腔或氣管，接通負壓，旋轉收集器頭部并緩慢退出，收集抽取的黏液，并用3 ml采樣液沖洗收集器1次(亦可用小兒導尿管接在50 ml注射器上來替代收集器)。d.深咳痰液：用清水(勿用含消毒劑的漱口液)漱口2～3次，有假牙者取出假牙后漱口，要求病人深咳后，將咳出的痰液收集于含3 ml采樣液(細胞保存液)的50 ml 螺口痰杯中。e.支氣管灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管(約30 cm深處)，注入5 ml生理鹽水，接通負壓，旋轉收集器頭部并緩慢退出。收集抽取的黏液，并用采樣液沖洗收集器1次(亦可用小兒導尿管接在50 ml注射器上來替代收集)。f.肺泡灌洗液：局部麻醉后將纖維支氣管鏡通過口或鼻經過咽部插入右肺中葉或左肺舌段的支管，將其頂端契入支氣管分支開口，經氣管活檢孔緩緩加入滅菌生理鹽水，每次30～50 ml，總量100～250 ml，不應超過300 ml。②血液標本：按項目要求選擇正確的真空采集管采集血液標本4 ml進行檢測。③大小便樣本：依據需求規范采集，旋緊管蓋。送檢標本容器外必須貼含樣本編號、種類、患者姓名及采樣日期等信息的識別條碼。

6 標本轉運

6.1 標本轉運箱①要求準備正規、密封良好、有生物危害標示及新型冠狀病毒標本標識的專用轉運箱。②轉運箱一般不進入隔離病房；如果是從隔離病房內取出，需要外部清潔消毒。

6.2 標本轉運人員轉運人員需二級生物安全防護(醫用防護口罩、乳膠手套、工作服外隔離衣、醫用防護帽)。

6.3 標本轉運流程①標本采集者或輔助者將樣本放入雙層密封標本袋內后，置于新型冠狀病毒專用轉運箱，75%酒精消毒后封閉，并由專人單獨轉運到實驗室。②轉運期間不能自行打開轉運箱，并保持轉運箱平穩，避免劇烈震蕩、顛簸。③轉運期間如果發生意外，轉運者不要自行處理轉運箱，須到接收地點說明情況，共同處理。

7 標本接收

7.1 實驗室接收人員接收人員須二級生物安全防護(醫用防護口罩、乳膠手套、工作服外隔離衣、醫用防護帽)；特殊情況時，升級為三級生物安全防護(醫用防護口罩、雙層乳膠手套、面屏/護目鏡、防護服、醫用防護帽，靴套)。

7.2 接收流程①接收者在生物安全柜內打開轉運箱，從密封袋取出標本，容器表面噴灑75%乙醇消毒。②通過LIS系統或手工登記完成每個樣本的簽收。③接收時確認新型冠狀病毒標本轉運箱標識，如果沒有標識，拒收標本。④確認樣本在裝箱前有消毒環節，并在開箱瞬間用75%乙醇噴灑消毒。

8 標本前處理

8.1 實驗室前處理人員前處理人員需三級生物安全防護(醫用防護口罩、雙層乳膠手套、面屏/護目鏡、防護服、醫用防護帽，靴套)。

8.2 前處理流程①血常規、凝血等閉管操作項目標本無需處理，直接上機檢測。②其他生化、免疫等項目需離心處理的血液標本，則盡可能在生物安全柜中放入和取出離心機轉子；離心時，操作者不能離開離心機，離心停止15 min以上取出，并在生物安全柜中消毒、開蓋；如果離心過程有異常聲響，則停止離心30 min以上后開蓋，并消毒。③新型冠狀病毒核酸檢測的呼吸道樣本作56 ℃30 min干浴滅活處理，待采樣管降至常溫后，才能在生物安全柜內開蓋。

9 實驗室檢驗

9.1 基本原則①所有新型冠狀病毒相關檢測必須在空間相對獨立的生物安全二級實驗室開展，操作人員需三級生物安全實驗室個人防護(醫用防護口罩、雙層乳膠手套、面屏/護目鏡、防護服、醫用防護帽，靴套)。②檢驗操作過程盡可能避免打開試管蓋，盡可能縮短打開的持續時間，盡可能避免產生氣溶膠。③檢驗操作過程如果必須打開試管蓋、或有可能產生氣溶膠的操作、或可能接觸標本本身，則必須在生物安全柜內進行，試管蓋棄去消毒。④檢驗人員資質及培訓：a.新型冠狀病毒肺炎的相關常規項目，如血常規、CRP、生化和免疫等檢測操作和結果審核人員均應持臨床檢驗資格證上崗。此外，進行新型冠狀病毒核酸檢測的人員還必須參加臨床基因擴增培訓，并獲得上崗證。b.從事新型冠狀病毒肺炎相關檢驗的檢驗人員，需接受新型冠狀病毒核酸檢測技術和相關生物安全培訓，考核合格后方能上崗工作。

9.2 新型冠狀病毒核酸檢測①在分子生物學實驗室設置專門的新型冠狀病毒核酸提取間(推薦負壓實驗室，并確保氣壓符合要求)進行病毒RNA提取，確保生物安全。②進行核酸提取時，呼吸道標本的開蓋、取樣、核酸的人工提取等操作都在生物安全柜內進行，或完成加樣后，轉移到全自動核酸提取儀。操作者需三級生物安全防護(醫用防護口罩、雙層乳膠手套、面屏/護目鏡、防護服、醫用防護帽，靴套)。③新型冠狀病毒的核酸檢測目前采用實時熒光RT-PCR方法，根據新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒推薦操作流程，完成加樣和熒光PCR儀擴增、檢測。操作者須二級生物安全防護(醫用防護口罩、乳膠手套、工作服外隔離衣、醫用防護帽)。④結果判讀：目前基于實時熒光RT-PCR的新型冠狀病毒核酸檢測試劑包括單靶標、雙靶標、三靶標三大類。引物和探針的設計推薦選用新型冠狀病毒的3個特異性區域，開放讀碼框1ab(ORF1ab)、核殼蛋白(N)及包膜蛋白(E)基因。其中ORF1ab區域特異性最高。⑤陽性結果確認：陽性結果重復檢測一次，如結果仍陽性，則確認該樣本結果陽性。⑥由檢測人員完成檢測和結果初審，審核者進行結果復核，陰性結果直接報告臨床；陽性結果由實驗室主任終審后發出陽性報告。⑦陰性結果，不能排除新型冠狀病毒感染，需要排除可能產生假陰性的因素，包括：樣本采集不合格；樣本采集過早或過晚；沒有正確的保存、運輸和處理樣本；技術本身存在的原因，如病毒變異、PCR抑制等問題。⑧間隔1天的兩次核酸陰性結果，是排除新型冠狀病毒感染的實驗室依據。

表1 單通道試劑結果判讀

表2 雙通道試劑結果判讀

表3 三通道試劑結果判讀

9.3 新型冠狀病毒肺炎相關的其他檢測包括新型冠狀病毒血清學檢測、血常規、尿常規、C反應蛋白、降鈣素原、肝酶、心肌酶、腎功、凝血功能等。①必須在空間相對獨立的二級生物安全實驗區(室)開展，并按三級防護標準要求做好人員防護(醫用防護口罩、雙層乳膠手套、面屏/護目鏡、防護服、醫用防護帽，靴套)。②所有檢測按相應檢驗項目的標準操作流程完成，報告結果。③結果及臨床意義：發病早期特異性IgM抗體升高，疾病中期到恢復期特異性IgG抗體4倍升高。發病早期白細胞總數正常或降低，淋巴細胞計數減少，部分患者出現肝酶、肌酶和肌紅蛋白增高。多數患者C反應蛋白和血沉升高，降鈣素原正常，嚴重者D-二聚體升高、外周血淋巴細胞進行性減少。重型患者動脈血氧分壓(PaO2)/吸氧濃度(FiO2)≤300 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，凝血功能異常。

10 檢驗后標本及相關廢棄物處理

①如果血液等標本需復查，應在生物安全柜中重新加蓋(新的)，按規定保存，否則和其他固體廢棄物一起裝入紅色廢棄物袋內密封，實驗室內就地高壓滅菌。②相關廢液，采用化學消毒或物理消毒方式處理，并對消毒效果進行驗證，確保徹底滅活。③消毒滅菌后的標本轉運出實驗室需符合生物安全原則、符合感染管理規范。

11 生物安全意外事故的處理

①新型冠狀病毒標本污染生物安全柜的操作臺造成局限污染：使用有效氯含量為3000 mg/L消毒液，消毒液需要現用現配，24小時內使用。②新型冠狀病毒標本造成實驗室污染：保持實驗室空間密閉，避免不相關人員出入，避免污染物擴散。使用3000 mg/L有效氯消毒液的毛巾覆蓋污染區。必要時(大量溢撒時)可用過氧乙酸加熱熏蒸實驗室，劑量為 2 g/m3，熏蒸過夜；或 20 g/L過氧乙酸消毒液用氣溶膠噴霧器噴霧，用量 8 ml/m3，作用1～2小時。熏蒸時室內濕度60%～80%。③清理污染物嚴格遵循活生物安全操作要求，采用壓力蒸汽滅菌處理，并進行實驗室換氣等，防止次生危害。