葫蘆素B對高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用

蔡珠蘭，吳青青，唐其柱

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科 代謝與相關(guān)慢病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430060)

糖尿病是一種由多種病因引起的慢性代謝紊亂性疾病。高糖導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells，VECs)損傷是多系統(tǒng)器官慢性并發(fā)癥的首發(fā)病理因素[1]，如微血管損傷引起的糖尿病腎病、神經(jīng)和視網(wǎng)膜病變；大血管損傷引起的冠狀動脈疾病、外周動脈疾病和腦血管疾病[2-3]。VECs通過產(chǎn)生和分泌各種血管活性物質(zhì)和生長因子來調(diào)節(jié)血管穩(wěn)態(tài)和血管生成。研究顯示，高糖能抑制活性物質(zhì)的產(chǎn)生，導(dǎo)致血管收縮、血管壁僵硬、血小板聚集和血管生成受損[4]。此外，高血糖還可通過誘導(dǎo)VECs凋亡和氧化應(yīng)激加重血管損傷[5]。葫蘆素B(cucurbitacin B，CuB)是一種四環(huán)三萜類化合物，從葫蘆科植物中提取。其對多種病理過程有重要影響，如抑制巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子[腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)1、IL-6]以緩解炎癥[6]；可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖以及促進(jìn)細(xì)胞自噬和凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用[7-8]；通過抑制蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O3a信號軸提高心肌細(xì)胞的自噬水平，從而改善心肌肥大和纖維化[9]。既往研究表明，CuB能夠激活A(yù)MP活化蛋白激酶及誘導(dǎo)胰高血糖素樣肽-1和胰島素的釋放，降低血糖水平[10]。然而，CuB改善糖尿病血管病變的具體機(jī)制尚不清楚。本研究通過建立高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)損傷模型，旨在探討CuB對高糖刺激下HUVECs損傷的作用。

1 材料與方法

1.1藥物和試劑 CuB購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；HUVECs株購于長沙 YrGene 公司；胰酶(批號：25200072)、1640培養(yǎng)基(批號：8118179)、胎牛血清(批號：16140071)購于美國Gibco公司；CCK-8(cell counting kit-8)試劑盒(批號：CK04)購于日本同仁化學(xué)研究所；活性氧類(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒(批號：S0033)購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Trizol 裂解液(批號：15596018)購于美國Thermo Fisher公司；SYBR Green(批號：4913914001)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號：4897030001)以及實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)儀(型號：LightCycler 96)購自瑞士Roche公司；原位末端缺口標(biāo)記法(Tunel)染色試劑盒(批號：S7111)購于美國Millipore公司。熒光倒置顯微鏡購于日本Olympus公司(型號：BX51TRF)。Matrigel基質(zhì)膠批號：356234)購于美國BD Biosciences公司。

1.2HUVECs的培養(yǎng) HUVECs用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，然后用0.25%胰酶消化，將細(xì)胞懸液接種至6孔板、24孔板或96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度至約80%時(shí)，經(jīng)RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12 h。采用隨機(jī)數(shù)字法進(jìn)行分組，對照組采用同等滲透壓的甘露醇；高糖組采用33.3 mmol/L的葡萄糖；實(shí)驗(yàn)組采用不同濃度的CuB(1、2、4、8、10 nmol/L)處理后予以高糖刺激。

1.3細(xì)胞增殖能力的檢測 利用不同濃度梯度的CuB培養(yǎng)HUVECs，分別在12、24、48 h檢測CuB對HUVECs存活率的影響。在96孔板中接種100 μL的細(xì)胞懸液。各組細(xì)胞予以不同的處理后，向培養(yǎng)板加入10 μL/孔的CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。通過以下公式計(jì)算檢測細(xì)胞的存活率：細(xì)胞增殖能力(%)=OD處理/OD對照。選取對細(xì)胞增殖有作用的藥物濃度繼續(xù)以下實(shí)驗(yàn)。

1.4炎癥相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄水平檢測 采用TRizol試劑提取HUVECs的RNA，三氯甲烷抽提，高速(12 000g×)離心15 min后取上層清亮的水相RNA，加入異丙醇使RNA沉淀，使用75%乙醇漂洗RNA沉淀，去RNA酶水溶解RNA。采用分光光度法檢測RNA純度及濃度。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA，采用Light Clcler 480 SYBRGreen Master Mix體系進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，并在實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)儀上檢測其水平。將對照組炎癥細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平設(shè)置為1，計(jì)算其他各組的表達(dá)水平。

1.5細(xì)胞ROS水平的檢測 將HUVECs接種于 6孔板。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入含2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(1 μL/mL)的RPMI 1640培養(yǎng)基，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育20 min。在避光條件下用RPMI 1640培養(yǎng)液漂洗細(xì)胞3次，使用倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.6細(xì)胞凋亡水平的檢測 將細(xì)胞接種于24孔板，1%多聚甲醛室溫處理細(xì)胞爬片10 min；乙醇與乙酸2∶1混合，于-20 ℃下處理細(xì)胞爬片5 min；加入Equilibration Buffer室溫下孵育至少10 s；滴加TdT Enzyme工作液37 ℃孵育1 h；加入Stop/WashBuffer工作液振蕩15 s后室溫孵育10 min；滴加Anti-Digoxigenin Fluorescein工作液室溫避光孵育30 min；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚封片；封片后在OLYMPUS熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照。

1.7HUVECs小管形成檢測 將96孔板預(yù)冷后每孔加入50 μL Matrigel基質(zhì)膠，放置于37 ℃培養(yǎng)箱30 min。待基質(zhì)膠凝固后，在膠上加入HUVECs以及100 μL條件培養(yǎng)基，然后于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后倒置顯微鏡下觀察拍照。Image Pro Plus軟件分析小管形成情況，測量平均小管長度。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度CuB對HUVECs增殖能力的影響 隨著高糖刺激時(shí)間的延長，各組細(xì)胞的增殖能力逐漸下降；與高糖組相比，8 mmol/L 和10 mmol/L CuB組細(xì)胞增殖能力提高；組間、時(shí)點(diǎn)間、組間和時(shí)點(diǎn)間交互作用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

組別0 h12 h24 h48 h對照組100±4109±6103±6105±5高糖組99±476±760±650±61 nmol/L CuB組98±573±865±755±62 nmol/L CuB組96±378±667±556±44 nmol/L CuB組98±780±472±360±38 nmol/L CuB組102±484±575±463±310 nmol/L CuB組97±588±680±570±5 組間F=37.116 P<0.001 時(shí)點(diǎn)間F=1 086.539 P<0.001 組間·時(shí)點(diǎn)間F=141.198 P<0.001

CuB：葫蘆素B；HUVECs：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；對照組：采用同等滲透壓的甘露醇；高糖組：采用33.3 mmol/L的葡萄糖

2.2各組HUVECs炎癥反應(yīng)標(biāo)志物mRNA轉(zhuǎn)錄水平的比較 各組促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6的mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與對照組相比，高糖組促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6的mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高(P<0.05)；與高糖組相比，8 nmol/L CuB組和10 nmol/L CuB組促炎因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平降低，且10 nmol/L CuB組低于8 nmol/L CuB組(P<0.05)。見表2。

組別TNF-αIL-1IL-6對照組1.00±0.061.00±0.161.00±0.15高糖組3.56±0.12a4.45±0.23a2.98±0.12a8 nmol/L CuB組2.43±0.11b3.45±0.23b2.09±0.22b10 nmol/L CuB組1.98±0.13bc2.87±0.34bc1.34±0.21bcF值548.044202.572143.057P值<0.001<0.001<0.001

HUVECs：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白細(xì)胞介素；CuB：葫蘆素B；對照組：采用同等滲透壓的甘露醇；高糖組：采用33.3 mmol/L的葡萄糖；a與對照組比較，P<0.05；b與高糖組比較，P<0.05;c與8 nmol/L CuB組比較，P<0.05

2.3各組HUVECs的ROS表達(dá)水平比較 與對照組相比，高糖組細(xì)胞的ROS熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(P<0.05)；與高糖組相比，8 nmol/L CuB組和10 nmol/L CuB組的細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度減弱，且10 nmol/L CuB組弱于8 nmol/L CuB組(P<0.05)。見表3及圖1。

組別ROS凋亡水平(%)平均小管長度(μm)對照組1.00±0.233.0±1.4423±47高糖組5.65±0.54a25.7±4.7a143±65a8 nmol/L CuB組3.42±0.23b17.8±4.0b254±58b10 nmol/L CuB組2.12±0.54bc12.4±4.0bc309±54bF值138.54538.09925.653P值<0.001<0.001<0.001

HUVECs：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；ROS：活性氧類；對照組：采用同等滲透壓的甘露醇；高糖組：采用33.3 mmol/L的葡萄糖；a與對照組比較，P<0.05；b與高糖組比較，P<0.05;c與8 nmol/L CuB組比較，P<0.05

2.4各組HUVECs的凋亡水平比較 與對照組相比，高糖組的凋亡陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增加(P<0.05)；與高糖組相比，8 nmol/L CuB組和10 nmol/L CuB組的凋亡陽性細(xì)胞數(shù)目減少，且10 nmol/L CuB組少于8 nmol/L CuB組(P<0.05)。見表3及圖2。

2.5各組HUVECs的平均小管長度比較 培養(yǎng)6 h后，高糖組的平均小管長度明顯低于對照組(P<0.05)；與高糖組相比，8 mmol/L CuB組和10 mmol/L CuB組的平均小管長度均增長(P<0.05)，但8 mmol/L CuB組和10 mmol/L CuB組的平均小管長度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3及圖3。

3 討 論

VECs位于血液和血管壁之間，它不僅能完成血液和組織液的物質(zhì)交換，還能合成及分泌大量的細(xì)胞因子和血管活性物質(zhì)，對穩(wěn)定血管正常的結(jié)構(gòu)和功能、調(diào)控血液信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和血液凝固等有重要影響[11]。VECs的炎癥促進(jìn)了胰島素抵抗的增加和胰島β細(xì)胞功能受損，炎癥介質(zhì)的釋放加重血管病變和動脈粥樣硬化斑塊形成[12-13]。既往研究提出，CuB能夠以劑量依賴方式降低TNF-α、IL-6的表達(dá)水平，減輕肺水腫，抑制肺部炎癥反應(yīng)[14]。本研究結(jié)果顯示，高糖刺激下，HUVECs中TNF-α、IL-1、IL-6的mRNA表達(dá)水平明顯升高，CuB預(yù)處理后炎癥因子的mRNA水平降低提示CuB可明顯降低炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平，且高劑量的CuB抑制效果更為顯著。

持續(xù)的高糖刺激下，線粒體高代謝活動導(dǎo)致ROS生成增多，同時(shí)抗氧化酶不足[15]，如過氧化氫、超氧陰離子和單態(tài)氧可以誘導(dǎo)細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物的積累，造成VECs的損傷。

CuB：葫蘆素B；HUVECs：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；ROS：活性氧類

CuB：葫蘆素B；HUVECs：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

CuB：葫蘆素B；HUVECs：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

既往研究發(fā)現(xiàn)，CuB具有抗氧化特性，其通過抑制脂質(zhì)過氧化和直接清除羥基自由基、超氧陰離子、單態(tài)氧發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用[16]。本研究結(jié)果顯示，高糖刺激使HUVECs內(nèi)ROS水平明顯升高，而CuB可以顯著抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，部分逆轉(zhuǎn)高糖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激水平，且CuB高劑量組ROS產(chǎn)生顯著減少。

高糖刺激增加了電壓依賴性陰離子通道轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，電壓依賴性陰離子通道的上調(diào)增加了線粒體細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)了細(xì)胞色素C的釋放，抑制VECs生長，并誘發(fā)VECs凋亡[17]。腫瘤研究發(fā)現(xiàn)，CuB可以通過誘導(dǎo)啟動子去甲基化和抑制Notch信號通路誘導(dǎo)G/M期阻滯和胱天蛋白酶介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[18-19]。本研究中，高糖刺激后HUVECs凋亡陽性細(xì)胞數(shù)目增多，CuB預(yù)處理后凋亡陽性細(xì)胞數(shù)目減少，提示CuB可能具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞凋亡的雙重作用，且其作用的傾向性取決于細(xì)胞的類型。

長期暴露于持續(xù)高血糖下，血管的完整性喪失，細(xì)胞與細(xì)胞間易于分離，VECs顯示出功能失調(diào)。此外，高糖還影響血管的生成，血小板衍生生長因子對維持毛細(xì)血管的穩(wěn)定性具有重要作用，在高糖刺激下，血小板衍生生長因子、血管生成素2和血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)異常，造成微血管的形成受限[20]。小管形成實(shí)驗(yàn)可以模擬體內(nèi)微血管生成，本研究結(jié)果顯示高糖刺激后小管的長度顯著減少，而CuB預(yù)處理后小管的長度增加。表明CuB可以逆轉(zhuǎn)高糖導(dǎo)致的小管形成不良，增加小管長度，改善小管形成能力，提示CuB可能有助于微血管的生成。綜上可知，CuB可顯著減少高糖誘導(dǎo)的HUVECs炎癥因子表達(dá)、抑制氧化應(yīng)激損傷、降低細(xì)胞凋亡水平，提高細(xì)胞的增殖活力和小管形成能力，提示CuB可能成為防治糖尿病血管病變的新型藥物。然而其在體試驗(yàn)有待開展，具體分子生物學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步探討。