一測多評方法應用于高效液相色譜法測定防曬產品中15種防曬劑的含量

郭 潔,劉 齊,劉成浩,韓蕭茜,楊 玲,杜 勇

(北京市藥品檢驗所,北京102206)

隨著經濟的發展和社會的進步,人們對健康和美麗的追求愈加強烈。為了避免紫外線輻射對皮膚造成的各種損傷以及追求白皙膚色的審美要求,采取積極有效的防曬措施已經成為大眾的共識。為滿足人民群眾日益增長的需要,研究人員不斷研發多種配方多種劑型的防曬產品,使用頻率呈現明顯的增大趨勢。但防曬劑的過多使用,會使人體產生諸如過敏、接觸性皮炎等不良反應[1-7]。因此,國家對防曬產品的監管和要求日趨嚴格,如防曬劑應與批準配方一致,且應在產品標簽上標明,其含量應符合相產規定。2015年版《化妝品安全技術規范》[8]中,規定了苯基苯并咪唑磺酸等15種防曬劑的高效液相色譜方法,所測定項目涵蓋了目前市售防曬產品中使用的絕大多數化學類防曬劑,可準確測定其含量。但是該方法需要同時使用15種標準品,提高了檢測成本,分別配制對照品溶液也增加了操作時間,不利于檢驗工作的高效完成。

一測多評法整合了內標、校正因子、紫外百分吸收系數等方法的優勢,借助待測物中有效成分的內在函數和比例關系,以一個標準品為參照物,建立該成分與其他成分間的相對校正因子,并通過其計算含量,實現多組分的同時測定。該方法可以減少標準品使用數量,降低檢測成本,節約檢測時間,已經在中藥材、中成藥及食品的質量評價中得到了較為廣泛的應用[9-21]。

本工作依據文獻[22-24]的技術要求,建立一種簡便高效的測定防曬產品中多種防曬劑含量的分析方法,確定以二苯酮-3為參照物,采用一測多評法測定苯基苯并咪唑磺酸、二苯酮-4、對氨基苯甲酸、二苯酮-3、P-甲氧基肉桂酸異戊酯、4-甲基芐亞基樟腦、二甲基PABA乙基己酯、丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷、奧克立林、甲氧基肉桂酸乙基己酯、水楊酸乙基己酯、胡莫柳酯、乙基己基三嗪酮、亞甲基雙-苯并三唑基四甲基丁基酚和雙-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪等15種防曬劑的含量,并采用回歸方程法同步測定并加以驗證。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Aglient-1100型高效液相色譜儀;島津LC-20AD高效液相色譜儀;Waters e2695型高效液相色譜儀(方法學考察所用);Mettler Toledo XS-205型電子分析天平;SB-25-12D型超聲波清洗器;Mili-Q Advantage型純水機。

苯基苯并咪唑磺酸標準儲備溶液:4.950 g·L－1,稱取適量苯基苯并咪唑磺酸標準品,用1 mol·L－1氫氧化鈉溶液1 mL溶解并轉移至10 mL棕色容量瓶中,用體積比為250∶450∶300∶0.2的甲醇-四氫呋喃-水-高氯酸混合溶液(以下簡稱為混合溶劑)稀釋至刻度,混合均勻。

二苯酮-4、對氨基苯甲酸、二苯酮-3、P-甲氧基肉桂酸異戊酯、4-甲基芐亞基樟腦、二甲基PABA乙基己酯標準儲備溶液:分別稱取各標準品適量,用稀釋溶劑溶解并轉移至10 mL棕色容量瓶中,用混合溶劑稀釋至刻度,混合均勻,配制5.073,5.060,5.041,5.226,5.048,5.123 g·L－1的二苯酮-4、對氨基苯甲酸、二苯酮-3、P-甲氧基肉桂酸異戊酯、4-甲基芐亞基樟腦、二甲基PABA乙基己酯的標準儲備溶液。

丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷、奧克立林、甲氧基肉桂酸乙基己酯、水楊酸乙基己酯、胡莫柳酯、乙基己基三嗪酮、亞甲基雙-苯并三唑基四甲基丁基酚、雙-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪標準儲備溶液:分別稱取各標準品適量,用四氫呋喃溶解并轉移至10 mL棕色容量瓶中,用四氫呋喃稀釋至刻度,混合均 勻,配制 5.018,5.393,5.208,5.089,5.323,1.088,1.036,1.007 g·L－1的丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷、奧克立林、甲氧基肉桂酸乙基己酯、水楊酸乙基己酯、胡莫柳酯、乙基己基三嗪酮、亞甲基雙-苯并三唑基四甲基丁基酚、雙-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪的標準儲備溶液。

苯基苯并咪唑磺酸標準品(批號為155797,純度為93.6%)、二苯酮-4標準品(批號為20102,純度為99.0%)、對氨基苯甲酸標準品(批號為112395,純度為99.9%)、二苯酮-3標準品(批號為14971-01,純度為100%)、P-甲氧基肉桂酸異戊酯標準品(批號為G0L414,純度為98.9%)、4-甲基芐亞基樟腦標準品(批號為 G161980,純度為99.0%)、4-甲基芐亞基樟腦標準品(批號為102303,純度為99.0%)、二甲基PABA乙基己酯標準品(批號為102303,純度為99.2%)、丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷標準品(批號為40814,純度為98.9%)、奧克立林標準品(批號為752831,純度為98.7%)、甲氧基肉桂酸乙基己酯標準品(批號為B0002222,純度為99.8%)、水楊酸乙基己酯標準品(批號為G131868,純度為99.4%)、胡莫柳酯標準品(批號為40429,純度為99.6%)、乙基己基三嗪酮標準品(批號為F0 H178,純度為99.5%)、亞甲基雙-苯并三唑基四甲基丁基酚標準品(批號為G155801,純度為99.9%)和雙-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪標準品(批號為F0G275,純度為98.7%)等15種防曬劑標準品。

四氫呋喃和甲醇均為色譜純;高氯酸為分析純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

CAPCELL PAK C18色 譜 柱 (4.6 mm ×250 mm,5μm);流量為1.0 mL·min－1;柱溫為30℃;檢測波長為311 nm;進樣體積為10.0μL。流動相:A為甲醇,B為四氫呋喃,C為0.008 2 mol·L－1高氯酸溶液,梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

1.3 試驗方法

取本品棄去部分(細頸容器內樣品棄去最初擠出的1 cm樣品,廣口容器內樣品刮棄表面層),稱取0.25 g樣品于25 mL具塞試管中,加15 mL混合溶劑溶解,渦旋混勻,超聲提取30 min,用稀釋溶劑稀釋至刻度,在8 000 r·min－1轉速下離心10 min,移取上清液1.0 mL于10 mL容量瓶中,用稀釋溶劑定容,混合搖勻后經過0.45μm濾膜過濾,得到待測溶液,按照儀器工作條件進行測定。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

按照儀器工作條件對15種防曬劑的混合標準溶液和編號為291的實際樣品進行測定,色譜圖見圖1。

圖1 15種防曬劑混合標準溶液和實際樣品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of 15 sunscreen agents mixed standard solution and the substantial sample

由圖1可知:15種防曬劑的分離效果良好,且該方法對于實際樣品中防曬劑的測定無干擾,說明該方法對于測定防曬產品中的防曬劑是可行的。

2.2 標準曲線

按照儀器工作條件對15種防曬劑的混合標準溶液系列進行測定,以各防曬劑的質量濃度為橫坐標,與其對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果表明:15種防曬劑在一定范圍內與其對應的峰面積之間呈線性關系,線性范圍、線性回歸方程和相關系數見表2。

表2 線性范圍、線性回歸方程和相關系數Tab.2 Linear range,linear regression equation and correlation coefficient

表2 (續)

2.3 精密度試驗

對15種防曬劑的混合標準溶液平行測定6次,記錄各防曬劑的峰面積。結果發現:苯基苯并咪唑磺酸等15種防曬劑的色譜峰面積的相對標準偏差(RSD)分 別 為 0.30%,0.20%,0.30%,0.20%,0.20%,0.20%,0.20%,0.30%,0.20%,0.20%,0.30%,0.60%,0.20%,0.50%,0.30%,說 明 該 方 法的精密度良好。

2.4 穩定性試驗

將15種防曬劑的混合標準溶液分別放置0,4,8,12,24 h后進行測定,記錄各防曬劑的峰面積。結果發現:苯基苯并咪唑磺酸等15種防曬劑的色譜峰面積的 RSD 分別為 0.90%,0.80%,0.80%,1.1%,0.60%,0.90%,1.2%,0.70%,0.60%,1.1%,1.4%,1.0%,0.80%,0.80%,0.70%,表 明15 種 防 曬劑的混合標準溶液在24 h內能夠穩定存在。

2.5 相對校正因子的計算

試驗采用多個質量濃度點計算相對校正因子,計算方法見公式(1):

式中:fsi為相對校正因子;As為參照物標準品s的峰面積,μV·s－1;ρs為參照物標準品s的質量濃度,mg·L－1;Ai為待測組分標準品i的峰面積,μV·s;ρi為待測組分標準品i的質量濃度,mg·L－1。

以二苯酮-3為參照物,根據進樣量不同,分別計算其余14種防曬劑的相對校正因子,以其平均值作為最終結果,并計算相對校正因子的RSD,結果見表3。

表3 14種防曬劑的相對校正因子Tab.3 Relative correcting factors of the 14 sunscreen agents

結果表明:不同進樣體積所求得的相對校正因子重現性較好,RSD為0.20%～2.0%。

2.6 相對保留時間的確定

試驗以二苯酮-3為參照物,分別計算其余14種防曬劑的相對保留時間,計算方法見公式(2):

式中:tRa為待測組分的保留時間,min;tRs為參照物的保留時間,min;ras為相對保留時間。

苯基苯并咪唑磺酸等14種防曬劑的相對保留時間見表4。

2.7 系統耐用性考察

試驗通過將本方法中所選用的CAPCELL PAK C18色譜柱更換為不同品牌型號的色譜柱(ZORBAX SB-C18色譜柱、inertsilODS-3色譜柱、Kromasil 100-5-C18(Kromasil)色譜柱和UG-120色譜柱)來考察相對校正因子及相對保留時間的變化情況,結果發現:ZORBAX SB-C18色譜柱對15種防曬劑的分離效果良好,相對校正因子變化幅度較小,相對平均偏差(RAD)為0.10%～2.8%,具體見表5;其他型號的色譜柱對的15種防曬劑的分離效果均不理想,部分防曬劑無法實現基線分離,這是由于2015年版《化妝品安全技術規范》[8]中15種防曬劑的測定方法對于色譜柱具有一定的選擇性。因此,在所選的色譜柱可完全分離15種防曬劑的情況下,本方法具有適用性。

表4 14種防曬劑的相對保留時間Tab.4 Relative retention time of the 14 sunscreen agents

試驗進一步比較了CAPCELL PAK C18色譜柱和ZORBAX SB-C18色譜柱這兩種類型的色譜柱對15種防曬劑的相對保留時間,計算RAD,結果見表6。

表5 不同色譜柱測得相對校正因子Tab.5 Relative correction factors determined with different chromatographic columns

表6 不同色譜柱的相對保留時間Tab.6 Relative retention times determined with different chromatographic columns

15種防曬劑在22 min內出峰完畢,某些防曬劑間距較近(例如峰5和峰6的出峰間隔為0.31 min,峰8和峰9的出峰間隔為0.33 min,峰11和峰12的出峰間隔為0.21 min),僅以相對保留時間定位可能造成混淆,因此在今后的試驗中可采用適當增加對照品定位的方式(除參照物二苯酮-3以外,還可增加對氨基苯甲酸、P-甲氧基肉桂酸異戊酯、奧克立林、水楊酸乙基己酯和乙基己基三嗪酮)輔助確定各個防曬劑的準確位置,在使用少量對照品的情況下,即可準確進行多種防曬劑含量的測定。

同一液相系統調整柱溫后,相對校正因子重現性良好,RSD為0.10%～1.6%,具體見表7,表明該方法可適用于不同的試驗環境。

表7 不同柱溫測得相對校正因子Tab.7 Relative correction factors determined at different column temperatures

分別更換不同品牌型號的液相色譜儀后,相對校正因子重現性良好,RSD為0.60%～1.7%,具體見表8。

試驗表明,該方法可適用于不同的色譜系統。

表8 不同儀器測得相對校正因子Tab.8 Relative correcting factors determined with different instruments

2.8 樣品分析

分別采用標準曲線法(SCM)和一測多評法(QAMS)計算24批樣品中防曬劑的含量,并計算測量值的RAD,其中批號為291、294和298的測定值和RAD見表9。批號為140、400和78的測定值和RAD見表10。

表9 批號為291、294和298的樣品分析結果Tab.9 Analytical results of samples with lot numbers 291,294 and 298 %

結果表明:兩種方法對于多個組分測定值的RAD為0.10%～2.5%,且SCM 和 QAMS的測定結果基本一致。

本工作建立了市售防曬產品中苯基苯并咪唑磺酸等15種防曬劑的一測多評測定方法,在改變柱溫及更換儀器的條件下,相對校正因子重現性較好。測定了24批市售防曬產品,對比了一測多評法和標準曲線法的測定結果,證明兩種方法得到的測定結果基本一致,可以在確定色譜柱型號的前提下,實現以二苯酮-3為參照物,對防曬產品中15種防曬劑的含量進行同時測定。原方法需稱量15種防曬劑標準品,分別制成標準儲備溶液后,再配制混合標準溶液系列進行測定。采用一測多評方法僅需稱量二苯酮-3標準品適量,配制標準溶液,另取其他5種標準品配制成定位溶液,即可判斷15種防曬劑的位置,并測定其含量,大大減少了標準品的使用量,節約了操作時間、降低了分析成本且提高了工作效率,同時保證了測定結果的準確性。

表10 批號為140、400和78的樣品分析結果Tab.10 Analytical results of samples with lot numbers 140,400 and 78 %