新疆地區一株羊駝源鏈球菌的分離鑒定與耐藥性分析

井郁金 金映紅 參都哈西·加吾丁 王杰 趙潔雅 馬文戈 黃炯 夏俊

摘? ? 要：為了解新疆北部某羊駝養殖場病死羊駝的病因，從死亡羊駝的肝臟及其心臟血液樣品中分離培養病原菌。本試驗采用細菌分離、革蘭氏染色、生化反應鑒定和PCR試驗鑒定，進行動物致病性試驗和抗菌藥的敏感性試驗。結果表明，革蘭氏染色呈陽性，球菌，生化指標和PCR結果均與鏈球菌相符。序列結果表明，分離株為鏈球菌，與一株新型的鏈球菌（序列號為NR_159140.1）同源性最高;動物致病性試驗中白兔接種100 μL·只-1，均在72 h內死亡，病死率為100%。藥敏試驗表明，分離株對環丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素、頭孢曲松鈉、阿奇霉素、氟苯尼考、頭孢曲松鈉、替米考星均敏感，而對克林霉素和氨芐西林有一定的耐受性。本試驗從羊駝上分離得到的病原菌為新型的鏈球菌屬成員，這為新疆地區羊駝鏈球菌的分子流行病學以及防治鏈球菌病提供參考。

關鍵詞：羊駝;鏈球菌;分離鑒定;藥敏試驗

中圖分類號：S858.299? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.03.010

Identification and Drug Resistance Analysis of Streptococcus Isolated from Alpaca? in Xinjiang

JING Yujin1， JIN Yinghong2， JIAWUDING·Canduhaxi2， WANG Jie2， ZHAO Jieya1， MA Wenge2， HUANG Jiong2， XIA Jun2

（1.College of Animal Medicine， Xinjiang Agricultural University， Urumqi， Xinjiang 830009， China; 2.Veterinary Research Institute of Xinjiang Academy of Animal Science（Animal Medical Research Center of Xinjiang Academy of Animal Science），Urumqi， Xinjiang 830011，China）

Abstract： In order to understand the cause of dead alpacas in an alpaca farm in northern Xinjiang， pathogenic bacteria were isolated and cultured from dead alpaca liver and heart blood samples. This test used the methods of bacterial isolation， Gram staining， biochemical reaction identification， and PCR test identification to conduct animal pathogenicity tests and antimicrobial sensitivity tests. The results showed that Gram staining was positive， cocci， biochemical indicators and PCR results were consistent with streptococcus. The sequence results showed that the isolate was streptococcus， which has the highest homology with a new strain of streptococcus.（NR_159140.1） In the animal pathogenicity experiment， white rabbits were inoculated with 100 μL·head-1， and all died within 72 h. The case fatality rate was 100%. The drug sensitivity test showed that the isolates were sensitive to ciprofloxacin， levofloxacin， gentamicin， ceftriaxone sodium， azithromycin， flufenicol， ceftriaxone sodium， and telmicoxin， but clindamycin and ampicillin had a certain tolerance. The pathogenic bacteria isolated from alpaca in this experiment were members of the new streptococcus， which provided a reference for the molecular epidemiology of streptococcus from alpaca in Xinjiang and the prevention and treatment of streptococcosis.

Key words： alpaca; streptococcus; isolation and identification; drug seasitirity test

羊駝（Alpaca）原產于南美洲的安第斯山脈，又叫南美小型駝，別名美洲駝[1]。目前，據不完全統計，新疆羊駝的存欄量為400只左右[2]，現在研究者對羊駝的疾病防控認識不充分，研究不深入。

鏈球菌在自然界中分布非常廣泛，革蘭氏染色呈陽性，是有莢膜多呈雙球形的細菌，間或有4～6個短鏈，偶見個別單球散在分布。其可致多種動物發病，易感動物是綿羊，山羊次之[3]。近年在駱駝上有少數報道[4- 5]，均表現為后肢球結下感染，出現潰瘍面或化膿皰，關節腫大，但羊駝因鏈球菌病致死的國內外少見到報道[6-7]。

2019年1月，實驗室收到新疆伊犁地區某養殖場死亡羊駝的病料。該養殖場羊駝存欄量35只，在不到一個月的時間內4只死亡。死亡前出現全身性出血性敗血癥及漿液性肺炎與胸膜肺炎等癥狀。在2018年11—12月期間，共發病死亡羊駝4只。發病羊駝均表現出精神萎靡、食欲不振、咳嗽等;剖檢后可見敗血癥病變，大葉性肺炎、肺肝變、肝臟腫大、膽囊腫大等。經過病原分離、培養特性、菌落形態致病力和生化試驗等初步認為病原為鏈球菌，進行PCR鑒定，結果與鏈球菌的同源性高達97%。本次試驗為羊駝健康養殖和對羊駝鏈球菌感染的診斷和治療有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 病料采集 按照無菌操作要求采集病死羊駝的心臟、肝臟和肺臟。

1.1.2 主要試劑 BHI培養基購自青島海博生物技術有限公司;Taq PCR Master Mix（2×，blue dye）購自生工生物工程（上海）股份有限公司;革蘭氏染色液購自北京索萊寶科技有限公司;TAE、DL-2000 DNA Marker購自天根生化科技（北京）有限公司，生化試劑及其它試劑均為國產分析純產品。

1.1.3 試驗動物 長耳白兔4只，體質量（3±0.2） kg，購于新疆維吾爾自治區疾病預防控制中心。

1.2 方 法

1.2.1 細菌分離培養? 無菌取少量的羊駝心臟血液直接接種于BHI液體培養基中，37 ℃恒溫培養16～20 h;同時將剪取的肝臟和肺臟病料接種于BHI液體培養基和涂抹于BHI瓊脂培養基，37 ℃培養16～20 h。觀察菌落顏色和形態特征，并挑選形態一致的優勢單菌落。

1.2.2 染色鑒定 取少量培養物進行涂片與革蘭氏染色、顯微鏡下觀察及純化，將菌接種于BHI液體中留用，置于4 ℃備用。

1.2.3 生化反應試驗 取適量純化培養的菌置于生化反應管中進行一系列的生化試驗鑒定，37 ℃恒溫培養20～24 h。根據使用說明書，觀察并記錄結果。

1.2.4 16S rRNA基因PCR擴增 參考文獻報道[8]，設計細菌通用鑒定引物一對，上游5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游5′-ACGGTTACCTTGTT

ACGACTT-3′，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。將鏡下檢測的純培養物作為DNA模板，進行PCR擴增。PCR反應體系共50 μL：2×Taq PCR Master mix為25 μL;引物為2 μL，模板為1 μL;超純水22 μL;擴增程序為95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min;共30個循環;延伸需要72 ℃ 10 min，最后4 ℃保存。取PCR產物5 μL于1%的瓊脂糖凝膠膠孔中點樣后電泳，并在成像儀內成像進行鑒定。

1.2.5 16S rRNA基因序列測序 將所獲得的PCR產物測序，挑選不同種鏈球菌的16S rDNA基因序列，應用GenBank中的已知核酸序列進行BLAST比對分析，用MEGA X軟件進行系統發育樹的構建。

1.2.6 動物致病性試驗 把純培養物37 ℃搖菌18 h左右，制備成懸液。將試驗的健康白兔4只，隨機分成2組，每組2只。試驗組白兔采取靜脈注射菌液100 μL·只-1（約2.9×108 CFU·mL-1），對照組注射等量的生理鹽水。每隔12 h觀察發病和死亡情況，并詳細記錄。

1.2.7 藥物敏感性試驗 根據無菌操作嚴格要求[9]。將分離菌接種于BHI培養基中，37 ℃恒溫震蕩培養18～20 h后，用移液器取200 μL菌液，用滅菌玻璃棒均勻涂布于平板，待平板中的液體完全吸收后，選取常用的10種抗菌藥物紙片貼于營養瓊脂平板中，每張藥敏片間的距離盡量均等，于37 ℃培養箱培養18～24 h，對產生的抑菌圈直徑和判定標準判定結果。

2 結果與分析

2.1 細菌分離培養

病料均勻涂于平板后，該菌在BHI瓊脂平板上生長良好，菌落扁平、濕潤、透明、微小（圖1）。

2.2 染色鏡檢結果

革蘭氏染色鏡檢：組織涂片在鏡下可見藍色成雙排列的球菌。用取菌環釣取純培養物染色鏡檢，可見染色為革蘭氏陽性的球菌，成單/雙出現，或短鏈狀排列（圖2）。

2.3 生化反應結果

根據《常見細菌系統手冊》的參考標準和鏈球菌陽性對照標準菌株的生化結果進行判定。結果符合鏈球菌的特征，分離株的生化特性結果見表1。

2.4 16S rRNA PCR擴增結果

待電泳結束后在凝膠成像儀內呈像，拍照并保存圖片。結果：擴增出預計的目的條帶，大小為1 470 bp的片段，見圖3。

2.5 16S rRNA基因序列分析

將測定的序列結果在NCBI網站（ http：//www.ncbi.nlm.gov/BLAST）進BLAST搜索比對，其基因序列顯示為鏈球菌屬。用MEGA軟件繪制遺傳進化樹。結果表明，該菌與從綿羊乳房皮下膿腫分離的新型鏈球菌屬（streptococcus ovuberis strain，序列號為NR_159140.1）的同源性最高，可以達到97%;將分離株標記為SXJA1，可以確認該菌株是鏈球菌屬（圖4）。

2.6 動物致病性試驗

接種后8 h試驗組中的白兔精神不佳，活動減少。在接種72 h后全部死亡（圖5）。對照組接種72 h后的白兔均健康存活著。從死亡白兔的心臟血、肝臟中均分離到革蘭氏染色鏡檢出現大量呈鏈狀排列的藍紫色的球菌，與接種的菌株形態相同;該菌株對白兔具有致病性。

2.7 藥敏試驗結果

在試驗所用的10種藥物中，分離株僅對克林霉素和氨芐西林耐藥。對環丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素、頭孢曲松鈉、阿奇霉素、氟苯尼考、頭孢曲松鈉、替米考星均敏感（表2）。

3 結論與討論

羊駝的鏈球菌病是由鏈球菌屬的細菌引起羊駝出現敗血癥的一種傳染病[10]，多為散發。目前主要的防控措施是藥物殺菌。根據本養殖場的疫病疫情分析中發現，主要的臨床癥狀與剖檢結果是菌血癥和敗血癥。從發病到死亡，病程短暫，經濟損失嚴重，疑似細菌所致。為有效控制該病的傳播和擴散，及時進行了病原體的分離和鑒定。傳統鑒定細菌主要是以生物學特征為基礎，按照細菌的形態、生化特點等進行分類，但是卻因環境、培養條件等因素影響，結果的穩定性和可靠性都存在較大差異。筆者采用基因部分序列的分析，可以從分子水平上確定出病原體。從養殖場的發病情況，結合病死羊駝病料的剖檢變化，細菌培養和核苷酸序列的測定等，最終可判定導致羊駝死亡的主要病原是鏈球菌。剖檢有肺炎特征，實驗室也做了有關支原體的檢測，結果為陰性，故排除了支原體的感染，可以確診羊駝感染鏈球菌引發肺炎而致死。

在進化樹分析中分離菌SXJA1與分離株VB15-00779T的同源性最高[11]，文獻描述這是新型的未鑒定種的鏈球菌，與莫氏鏈球菌和駱駝鏈球菌的親緣關系最近，是鏈球菌屬的一個新的種。由于是一新型的菌株，目前的研究和參考文獻比較少，受條件因素影響的限制，未能繼續研究。

鏈球菌在環境中的存在十分廣泛，大部分都不具有致病性。在綜合全面地考慮問題時，環境因素也不容忽視。在新疆各地均存在致病性鏈球菌發病的報道[12]，尤其是未達到規模化養殖條件的場所。糞便污染和環境的臟亂差是主要的原因。隨著羊駝養殖業的迅速發展，集約化養殖羊駝也在迅速的發展，但是養殖新技術還需不斷完善。此次病死羊駝必須深埋，同時環境需要徹底消毒，防止該病的再次發生。

本試驗分離的菌株確診為羊駝源的鏈球菌，通過實驗室一系列的分離鑒定使得這次發病的診斷更加快速和精準。藥物的耐藥性試驗與分析中，該分離株的耐藥藥物只有兩種，對青霉素類和林可酰胺類耐藥，所以可以選擇其他種類的抗生素進防治。藥敏試驗也較為快速有效地檢測出菌株對各種抗菌藥的敏感性，為指導臨床合理用藥提供了一個方向，方便靈活選藥，選出最敏感的藥物。羊駝作為產毛型動物在未來有很高的經濟前景[13]，在新疆畜牧養殖業的發展過程中，羊駝的常見傳染病需要慢慢摸索和研究。分離到的鏈球菌能為后續相關的研究提供數據支持，試驗為新疆羊駝養殖中鏈球菌病的防治提供一定的科學依據。

參考文獻：

[1]呂雪峰， 邢巍婷， 許艷麗， 等. 新疆引進羊駝遺傳多樣性與系統發育研究[J]. 中國畜牧獸醫， 2017，44（9）：2709-2715.

[2]楊啟堂. 新疆羊駝養殖業的進展研究[C]//中國畜牧業協會. 第四屆（2015）中國駱駝大會論文匯編， 2015.

[3]付明哲， 李長安， 白濤， 等. 羊鏈球菌的自動鑒定和耐藥性分析[J]. 西北農業學報， 2014，23（1）：36-40.

[4]周宇， 邱啟官. 一例駱駝馬鏈球菌病診治[J]. 湖南畜牧獸醫， 2014（5）：30-31.

[5]伊特格勒， 莫日根高娃， 蘇日拉格， 等. 駱駝鏈球菌病的診治[J]. 中國畜牧獸醫文摘， 2016，32（1）：219.

[6]CORPA J M， CARCALLO F， ANDERSON M L， et al. Streptococcus equi subspecies zooepidemicus septicemia in alpacas： three cases and review of the literature[J]. J vet diagn invest， 2018，30（4）：598-602.

[7]喻昌盛， 楊啟堂. 一例羊駝瘤胃酸中毒繼發鏈球菌感染的診治[C]//中國畜牧業協會. “一帶一路”駱駝科技、產業與文化國際研討會暨第五屆中國駱駝產業發展大會論文集， 2017.

[8]師福山， 趙德明. 禽大腸桿菌的分離與16S rRNA的鑒定[J]. 中國畜牧獸醫， 2009，36（2）：111-113.

[9]陳楠楠， 秦平偉， 尹珺伊， 等. 東北民豬源停乳鏈球菌的分離鑒定與藥敏試驗[J]. 動物醫學進展， 2019，40（8）：126-130.

[10]張常印. 進境美洲駝的風險分析[D]. 南京：南京農業大學， 2004.

[11]ZAMORA L， PEREZ-SANCKO M， FERNANDEZ-GARAYZ

ABAL J F， et al. Streptococcus ovuberis sp. nov.， isolated from a subcutaneous abscess in the udder of a sheep[J]. Int j syst evol microbiol， 2017，67（11）：4340-4344.

[12]吳靜， 趙文勝. 南疆地區豬鏈球菌流行病學調查[J]. 中國動物檢疫， 2014，31（3）：58-60.

[13]李維紅， 高雅琴， 王宏博， 等. 羊駝的研究現狀及應用前景[J]. 草食家畜， 2007（1）：10-11.