利用CRISPR/Cas9技術構建擬南芥IQM家族基因四突變體

魏麗茵 呂天曉 范甜 周玉萍 田長恩

摘 要之前，本研究組分別對IQM家族基因的功能進行了研究。不過，由于缺乏相應突變體而未能對該家族多基因同時突變所產生的生長發育改變進行研究。因此，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建IQM家族多基因突變體。分別在IQM家族4個成員的基因組上設計靶點接頭，通過同源重組構建成相應小載體sgRNA表達盒：LazAtU3d-AtU3b-AtU3d-AtU3b，并整合成pYLCRISPR/Cas9Pubi-N表達載體后轉入擬南芥。經抗生素抗性篩選，共獲得70株T0代植株。最后經過編輯靶點測序，得到2個IQM1～IQM4的四突變體株系。

關鍵詞擬南芥;IQM;四突變體;CRISPR/Cas9

IQM家族由6個成員組成，命名為IQM1～IQM6。生物信息學分析表明，IQM蛋白均含有1個IQ基序，其N-端和C-端分別與豌豆重金屬誘導蛋白6A和天花粉素具有較高的同源性，是1個全新的含IQ基序的家族（Zhou et al， 2010;田長恩等， 2013）。

本研究組長期從事IQM家族的功能研究，發現IQM1介導 CaM、光和部分非生物脅迫信號，調節氣孔運動和根生長（Zhou et al， 2012）。還發現，IQM1可通過與CAT2互作而增強其活性，繼而提高JA合成酶ACX2和ACX3的活性，增加JA含量和對灰質芽孢桿菌的抗性（Lv et al，2019）。IQM2可能通過影響光合作用而參與植物對病菌的反應（吳俊等，2017）。IQM3在葉、莖、花和根中的表達較強，但在莢果中很弱，與種子萌發及幼苗子葉膨大有關（周玉萍等，2009）;IQM3還可能通過抑制赤霉素的生物合成而參與對幼苗的側根數量和主根長度的調節（徐浩等，2019）。IQM4在植物非生物脅迫中發揮重要作用（蕭文慧等，2016）;還與種子休眠和萌發成正相關（Zhou et al， 2018）。

總之，IQM家族不同成員具有不同功能。因此，有必要構建擬南芥IQM家族的多突突變體，為深入研究擬南芥IQM家族基因的功能提供研究材料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以野生型擬南芥Columbia-0（Col-0）為基礎進行基因編輯，同時敲除IQM基因家族中的4個成員IQM1～IQM4。質粒pCambia1301和大腸桿菌（菌株 E.Coli DH5α）由本實驗室保藏;根瘤農桿菌（菌株 GV3101）由中國科學院華南植物園張明永教授友好轉贈的;CRISPR/Cas9基因編輯體系小載體 pYLsgRNA-AtU3d/LacZ、pYLsgRNA-AtU3b和大載體pYLCRISPR/Cas9Pubi-N均由華南農業大學劉耀光教授友好贈送。

1.2 實驗方法

參照Ma和Liu （2016）的CRISPR/Cas9基因編輯技術進行。首先，在IQM1至IQM4的基因組序列中設計4對靶點接頭（表1），分別退火連成小片段， 同源重組入經BsaI線性化的載體pYLsgRNA-AtU3d/LacZ和pYLsgRNA-AtU3b中，然后，進行gRNA表達盒擴增，回收預期擴增產物， 連接進雙元載體并轉化大腸桿菌;繼而，進行轉化菌落PCR鑒定， 選擇陽性克隆測序驗證;進一步，將驗證正確的質粒轉化農桿菌， 并用菌落PCR鑒定得到轉化農桿菌;再進一步，通過農桿菌蘸染花蕾法轉化野生型擬南芥， 收獲種子并在含有卡拉霉素（Kan）的培養基上篩選出抗性植株即候選T0代編輯植株;最后，用靶點上、下游引物（表1）對候選株系進行PCR擴增， 將產物測序， 選出雙鏈都成功編輯的轉基因植株留種，供純合子篩選。

2 結果與分析

本文利用CRISPR/Cas9對野生型擬南芥的4個基因（IQM1、IQM2、IQM3和IQM4）進行編輯。對編輯的T0代進行抗生素抗性篩選，共獲得70株抗性苗;繼而，對這些苗及其后代進行跨靶點PCR產品測序，在T4代中篩選到2個四突變體純合株系（iqm1 iqm2 iqm3 iqm4）-1和（iqm1 iqm2 iqm3 iqm4）-2，其相應的DNA序列和突變蛋白的氨基酸序列（見圖1）。

與野生型（WT）相比，四突變體（iqm1 iqm2 iqm3 iqm4）-1的突變位點分別是：iqm1，從起始密碼子ATG的A開始，在第41與42堿基之間插入1個A，導致其后序列發生移碼突變并提前終止，產生1個只有29個氨基酸殘基的突變蛋白，而IQM1共有526個氨基酸殘基（圖1-A）;iqm2：從起始密碼子ATG的A開始的第49至64堿基之間缺失16個堿基，導致其后序列發生移碼突變并提前終止，產生1個只有21個氨基酸殘基的突變蛋白，而IQM2共有605個氨基酸殘基（圖1-B）;iqm3：從起始密碼子ATG的A開始的第40至68堿基之間缺失29個堿基，導致其后序列發生移碼突變并提前終止，產生1個只有25個氨基酸殘基的突變蛋白，而IQM3有456個氨基酸殘基（圖1-C）;iqm4：從起始密碼子ATG的A開始在第170與171堿基之間上插入1個T，導致其后序列發生移碼突變并提前終止，產生1個只有81個氨基酸殘基的突變蛋白， 而野生型有532個氨基酸殘基（圖1-D）。

與上述突變體比較，另1個株系（iqm1 iqm2 iqm3 iqm4）-2只在IQM2中存在的不同：從起始密碼子ATG的A開始在第64與65堿基之間插入1個A，導致其后序列發生移碼突變并提前終止， 產生1個只有24個氨基酸殘基的突變蛋白， 而IQM2有605個氨基酸殘基（圖1-E）。

3 討論

本文利用CRISPR/Cas9技術對擬南芥IQM家族4個基因同時進行編輯，成功獲得2個四突變體株系（iqm1 iqm2 iqm3 iqm4）-1和（iqm1 iqm2 iqm3 iqm4）-2。之后，將在上述四突變體的基礎上，再編輯該家族其余的IQM5和IQM6基因，以期獲得IQM全家族基因的六突變體。為研究IQM家族基因同時突變對植物生長發育以及對環境反應的影響提供材料。

參考文獻

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