p-m TOR蛋白在結直腸癌組織中的表達及患者預后判斷中的價值

朱依青，張彤彤，2，鄭珺文，郝佳潔，蔡 巖，王明榮，梁建偉*，張 鈺，*

(1．國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院，分子腫瘤學國家重點實驗室，北京 100021；2．成都市第三人民醫院實驗醫學研究部，四川 成都610031；3．國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院，結直腸外科，北京 100021)

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的消化道惡性腫瘤。在世界范圍內，結直腸癌的發病率和死亡率分別位于惡性腫瘤的第3和第4位[1-2]。在我國，結直腸癌的發病率和死亡率均位居惡性腫瘤的第5位[3]，而且近年來我國結直腸癌的發病率呈現不斷上升趨勢。復發和轉移是結直腸癌患者死亡的主要原因[4-6]，然而依據現有的臨床病理指標尚不能準確預測結直腸癌患者的預后，因此迫切需要尋找有效的生物標志物，對患者術后復發及死亡風險進行更為準確地鑒別及分層。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian/mechanistic target of rapamycin，mTOR)是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于PI3K相關激酶超家族成員。mTOR是兩個不同的蛋白復合物，即mTOR復合物1和2(mTORC1和mTORC2)的催化中心。mTOR復合物通過磷酸化底物調節多種生物學過程，包括細胞生長、增殖、存活和細胞骨架組織等[7-9]。有報道顯示mTOR信號通路在多種惡性腫瘤中表達失調并與患者的預后不良相關[10-12]。然而，迄今為止結直腸癌中mTOR異常活化與患者預后的關系尚不明確。

在本研究中，我們采用組織芯片-免疫組織化學染色技術檢測p-mTOR(Ser2448，活性形式的mTOR)蛋白在結直腸癌及癌旁正常組織中的表達情況，探討pmTOR蛋白表達改變與結直腸癌臨床病理指標及患者預后的關系。

1 材料和方法

1.1 病例和標本

441例結直腸癌組織以及同一患者手術切端形態學正常的結直腸組織，取自于中國醫學科學院腫瘤醫院(2007年1月—2011年12月)，均為臨床診斷后剩余的、無壞死的新鮮組織，常規使用福爾馬林固定和石蠟包埋。所有患者均簽署了知情同意書，該項研究的設計和進行獲得中國醫學科學院腫瘤醫院倫理委員會的批準(NCC2016JZ-06)。

以組織病理學檢查為確診標準，并根據AJCC第八版結直腸癌分期系統對確認病例進行TNM分期。患者平均年齡57.3歲，中位年齡59.0歲(14～91歲)。其中，187名患者(42%)接受了輔助化療和/或放化療，輔助化療采用5-氟尿嘧啶為基礎的化療方案。無病生存率和總生存率為主要的研究終點。無病生存率定義為手術后一段時間內發生復發或轉移等疾病癥狀和體征的個體的百分比，總生存率定義為手術后一段時間內死亡個體的百分比。隨訪至少5年，97%(429/441)的患者有完整的隨訪信息，其中34%(148/441)的患者在隨訪期間出現腫瘤復發或轉移。

1.2 組織芯片-免疫組織化學染色檢測

每個病例選取3個典型的癌組織點和2個相鄰癌旁正常組織點，本室制作結直腸癌組織微陣列(TMAs)并制備4μm切片[13]。使用PV9000免疫組化試劑盒和DAB染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術公司)進行免疫組化檢測，按試劑盒說明進行操作。主要步驟如下：切片脫蠟至水化，3%的H2O2阻斷內源性過氧化物酶的活性，微波抗原修復，p-mTOR抗體孵育4℃過夜，DAB顯色，蘇木素復染、脫水、封片。p-mTOR一抗(Ser2448，#2976)購自CST公司，免疫組化實驗稀釋比為1∶100。將已知p-mTOR高表達的惡性腫瘤細胞的組織切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判斷

免疫組化反應出現棕黃色顆粒判斷為陽性，根據染色強度和染色面積百分比量化蛋白相對表達水平[14-15]。其中，著色程度的評分標準為：無染色0分，弱染色1分，中染色2分，強染色3分；染色面積的評分標準為：著色范圍≤10%為0分，＞10%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分。最終的評分是兩者得分之積。若兩者得分之積≥3分則為高表達，＜3分則為低表達。

1.4 統計學方法

采用統計學軟件SPSS 22.0進行統計學分析。采用配對t檢驗用于評估結直腸癌與鄰近正常組織的蛋白表達差異。采用Pearson卡方檢驗和Fisher精確檢驗分析p-mTOR的表達水平與臨床病理參數之間的相關性。采用Kaplan-Meier生存曲線及Log-rank檢測分析p-mTOR高表達與患者無病生存率和總生存率的關系，使用Cox比例風險模型確定獨立預后因素。

2 結果

2.1 p-mTOR在結直腸癌組織中高表達

使用含有441例結直腸癌組織和手術切端形態學正常的結直腸上皮的組織芯片，進行p-mTOR蛋白表達水平的免疫組織化學檢測，結果顯示p-mTOR主要定位于細胞膜和細胞質(圖1A)，其在結直腸癌組織中的陽性表達率為58%(254/441)，而在正常結直腸上皮中的陽性表達率僅為4%(17/441)，兩者之間表達水平差異顯著(P＜0.01，圖1B)。

A：p-mTOR蛋白的免疫組織化學染色結果；B：441例結直腸癌及鄰近正常結腸上皮中p-mTOR蛋白表達水平的比較.圖1 免疫組織化學法檢測結直腸癌組織中p-mTOR蛋白的表達

2.2 p-mTOR表達水平與結直腸癌臨床病理指標的關系

我們檢測了結直腸癌組織中p-mTOR的表達與臨床病理指標的關系，統計分析結果顯示，與未發生淋巴結轉移(N0)以及遠處轉移(M0)的結直腸癌患者相比，出現淋巴結轉移(N1/2)以及遠處轉移(M1/2)的患者組織中p-mTOR的表達水平更高。同時，T3/4期患者以及Ⅲ/Ⅳ分期患者的腫瘤組織中p-mTOR的表達水平高于T1/2期及Ⅰ/Ⅱ期患者(P均＜0.05)，而p-mTOR的表達水平與患者年齡、性別及組織學分級等指標間的差異無統計學意義(表1)。

2.3 p-mTOR表達水平與結直腸癌患者預后的關系

分析p-mTOR高表達對結直腸癌患者臨床預后的影響，結果顯示441例結直腸癌患者術后5年無病生存率和總生存率分別為65%和63%，無病生存時間和總生存時間分別為61和63個月。p-mTOR高表達患者的無病生存期和總生存期分別為52和60個月，明顯短于p-mTOR低表達患者的71和70個月，差異具有統計學意義(P均＜0.01，圖2)。以上結果提示，通過檢測p-mTOR的表達水平，可以預測結直腸癌患者的預后。

2.4 p-mTOR高表達是影響結直腸癌患者無病生存率和總生存率的獨立預后因素

p-mTOR表達水平和相關臨床病理特征與結直腸癌患者預后的關系見表2和表3。單因素分析和Cox多因素回歸分析結果顯示pT、組織學分級及p-mTOR表達水平是結直腸癌患者術后無病生存率和總生存率的獨立預后因素(P均＜0.01)。此外，輔助治療是結直腸癌患者總生存率的獨立預后因素(P=0.039)。

表1 結直腸癌組織中p-mTOR蛋白表達與臨床病理指標的關系

A：無病生存率；B：總生存率.根據結直腸癌組織中p-mTOR蛋白的免疫組化染色結果繪制Kaplan-Meier生存曲線，P值為Log-rank檢驗結果.HR：風險比；CI：置信區間.圖2 p-mTOR蛋白表達與結直腸癌患者5年無病生存率與總生存率的關系

表2 結直腸癌根治術患者術后無病生存率與總生存率的單因素Cox回歸分析

表3 結直腸癌根治術患者術后無病生存率與總生存率的多因素Cox回歸分析

3 討論

復發轉移是結直腸癌治療失敗及患者死亡的主要原因。準確判斷患者術后的復發轉移風險可幫助臨床醫生為患者制定更合理、更有針對性的隨訪及治療方案，有助于實現個體化的精準治療。因此，尋找、鑒定可準確識別高危結直腸癌患者的生物標志物在改善患者預后及提高其生存率方面具有重要意義及應用價值。

在本研究中，我們發現p-mTOR的表達水平在58%的結直腸癌病例中異常升高，其表達水平與結直腸癌患者的無病生存率和總生存率顯著相關，并且是獨立的不良預后因素。與我們的發現相似，近期有研究報道p-mTOR在74%的結直腸癌病例中高表達，并且是獨立的不良預后指標[10]。相反，早期的一項研究結果顯示，p-mTOR的表達水平與結直腸癌患者的預后無關[16]。因此，今后可能需要進行更多的研究以闡明mTOR異常活化與結直腸癌預后的關系。

由于mTOR信號轉導在腫瘤細胞生物學中起著極為重要的作用，它一直被認為是一個非常具有臨床應用前景的治療靶點，目前已有多種靶向抑制劑在進行惡性腫瘤治療的臨床試驗[17-19]。同時，以往有研究表明，mTOR通路的過度活化可促進結直腸癌的發生和發展[20-23]。我們的免疫染色結果顯示，在近60%的結直腸癌病例中存在mTOR的異常活化并與患者較高的復發和死亡風險密切相關。上述發現提示mTOR不僅可作為結直腸癌患者預后分層的分子標志，同時也可作為高危患者靶向治療的候選分子靶點。

綜上所述，本研究發現mTOR在結直腸癌組織中異常活化，p-mTOR的陽性表達與患者的不良預后密切相關并且是獨立的預后因素，提示mTOR的異常活化不僅可用于鑒別具有較高復發轉移風險的結直腸癌患者，而且可能成為這些高危患者治療的潛在分子靶點。

(感謝國家癌癥中心/國家腫瘤臨床研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院的趙傳多醫生在病例隨訪工作中給予的幫助)