基于代謝組學(xué)方法篩選大鼠血漿輻射敏感代謝物

趙 驊，陸 雪，蔡恬靜，李 爽，田 梅，劉青杰*

(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所，輻射防護(hù)與核應(yīng)急中國(guó)疾病預(yù)防控制中心重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088)

近年來(lái)，核能與電離輻射應(yīng)用廣泛，核事故和輻射突發(fā)事件也時(shí)有發(fā)生。運(yùn)用快速、高通量的生物分析技術(shù)估算大人群的受照劑量，是制定合理應(yīng)對(duì)措施和指導(dǎo)受照人員臨床治療的關(guān)鍵之處[1-3]。經(jīng)典的細(xì)胞遺傳學(xué)方法在估算生物劑量時(shí)，存在實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、分析較為復(fù)雜等局限性，難以應(yīng)對(duì)大人群受照劑量估算的要求[4-5]，因此探索新的快速、高通量的輻射敏感標(biāo)志物十分必要。

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，是研究生物系統(tǒng)全部代謝物的組成及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的學(xué)科，通過(guò)對(duì)內(nèi)源性小分子代謝物(相對(duì)分子質(zhì)量＜1 500)進(jìn)行定性或定量分析，反映機(jī)體在健康或疾病狀態(tài)下代謝活動(dòng)的變化，對(duì)于臨床癥狀出現(xiàn)之前的生理狀態(tài)評(píng)估具有重要意義，目前代謝組學(xué)技術(shù)已在藥理學(xué)、毒理學(xué)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[3，6-7]。本研究采用基于液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)(liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS)平臺(tái)的非靶向代謝組學(xué)方法，研究受到60Coγ射線全身照射的大鼠血漿代謝物的變化，篩選輻射敏感代謝物，并初步探索其代謝通路及構(gòu)建劑量-效應(yīng)曲線，為快速、高通量的輻射損傷生物標(biāo)志物研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

超快速液相色譜(美國(guó)ThermoFisher Scientific公司)；色譜柱UPLC BEH Amide(美國(guó)Waters公司)；QExactive四極桿軌道離子阱質(zhì)譜儀(美國(guó)ThermoFisher Scientific公司)。

1.2 動(dòng)物分組與照射條件

SPF級(jí)雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SYXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)地點(diǎn)為北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，屏障環(huán)境使用許可證號(hào)為SYXK(京)2016-0041。將大鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組和3個(gè)照射組，每組5只。將大鼠固定在運(yùn)輸盒后，在北京市輻射中心用60Coγ射線對(duì)其進(jìn)行全身照射，照射劑量分別為0、1、3、5 Gy，劑量率為1 Gy/min，源強(qiáng)為130 TBq，源靶距為84 cm，平均照射野為50 cm×50 cm。對(duì)照組大鼠未受到γ射線照射，其余實(shí)驗(yàn)條件均與照射組相同。本研究通過(guò)中國(guó)疾控中心輻射安全所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理福利委員會(huì)審查(中疾控輻動(dòng)[2019]001號(hào))。

1.3 血漿樣本制備

大鼠受照射后放回屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)7 d后，通過(guò)眼眶內(nèi)眥靜脈采血1～2 mL，置于EDTA抗凝管中，4℃、3 000 r/min離心10 min，取上清，分離的血漿分裝后凍存于-80℃冰箱。

1.4 樣本預(yù)處理

血漿樣本在4℃解凍，取100μL加入1.5 mL EP管，加入300μL的乙腈，充分振蕩15 s，進(jìn)行蛋白沉淀。4℃、12 000 r/min離心10 min，取上層溶液100μL，置于200μL內(nèi)襯管中，待測(cè)。

1.5 色譜條件

采用超快速液相色譜對(duì)血漿樣本進(jìn)行分離。流動(dòng)相A為乙腈、0.1%甲酸、10 mmol/L乙酸銨，流動(dòng)相B為水、0.1%甲酸、10 mmol/L乙酸銨。柱溫40℃，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量1.0μL[8]。洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 超快速液相色譜洗脫程序

1.6 質(zhì)譜條件

采用四極桿軌道離子阱質(zhì)譜儀對(duì)樣本進(jìn)行超高分辨率一級(jí)全掃描，采用正離子模式，電壓為3.7 kV，質(zhì)荷比掃描范圍為50～1 500。采用Xcalibur 2.2 SP1.48軟件進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。

1.7 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

用Progenesis QI軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，包括原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入、峰對(duì)齊、峰提取、歸一化處理，最終形成保留時(shí)間、質(zhì)荷比和峰面積的表格。采用SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)，用Progenesis QI及SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，根據(jù)變量權(quán)重(variable importance in projection，VIP)值及P＜0.05為篩選差異代謝物。代謝物鑒定方法采用人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)(human metabolome database，HMDB)進(jìn)行一級(jí)分子量匹配，比較質(zhì)譜的質(zhì)荷比或者精確分子質(zhì)量，誤差限制0.01 Da。用MetaboAnalyst 4.0及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路分析。不同組間代謝物相對(duì)含量采用t檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)量控制

將所有大鼠血漿樣本用移液器吸取10μL混合均勻后得到質(zhì)量控制樣本(quality control，QC)，其前處理方法與實(shí)測(cè)樣本相同。應(yīng)用PCA對(duì)QC樣本和實(shí)測(cè)樣本進(jìn)行分析。QC樣本是相同的成分，在PCA得分圖中相對(duì)聚集，表明系統(tǒng)穩(wěn)定性良好，數(shù)據(jù)可靠(圖1A)。大鼠血漿經(jīng)LC-MS分析后，共檢測(cè)到3 815個(gè)特征離子峰，發(fā)現(xiàn)的代謝物主要包括氨基酸類和肉堿類等幾類物質(zhì)。

2.2 主成分分析及正交偏最小二乘方判別分析

為觀察大鼠受到γ射線照射后代謝物總體的變化，將所有組大鼠血漿進(jìn)行PCA分析(圖1B)。在得分圖上彼此之間距離越遠(yuǎn)，表示差異越大。結(jié)果表明，經(jīng)射線照射后的大鼠血漿代謝譜發(fā)生了明顯的變化，模型的解釋率(R2X)為0.501，模型的預(yù)測(cè)率(Q2)為0.221，5 Gyγ射線照射組與對(duì)照組能夠明顯區(qū)分，而1 Gy、3 Gyγ射線照射組和對(duì)照組有一定的重疊。為獲得導(dǎo)致這種差異的代謝物信息，將對(duì)照組與5 Gyγ射線照射組進(jìn)一步采用監(jiān)督性的多維統(tǒng)計(jì)方法即正交偏最小二乘方判別分析(OPLS-DA)，5 Gyγ射線照射組與對(duì)照組能夠明顯區(qū)分，其模型的解釋率(R2Y)為0.998，模型的預(yù)測(cè)率(Q2)為0.933(圖2A)。為驗(yàn)證模型的有效性，對(duì)該模型重復(fù)進(jìn)行200次置換驗(yàn)證，圖2B中左側(cè)兩列的隨機(jī)實(shí)驗(yàn)數(shù)值均低于右上方的原始值，表明該模型未出現(xiàn)過(guò)擬合，具有良好的預(yù)測(cè)性和穩(wěn)定性。

A：質(zhì)控樣本與實(shí)測(cè)樣本；B：0、1、3、5 Gyγ射線照射組大鼠血漿樣本.圖1 主成分分析得分圖

A：5 Gyγ射線照射組與對(duì)照組大鼠血漿樣本正交偏最小二乘方判別分析；B：置換檢驗(yàn)?zāi)Ｐ万?yàn)證.左側(cè)兩列為重復(fù)進(jìn)行200次置換檢驗(yàn)的R2和Q2，右上方兩個(gè)點(diǎn)為最終得到最優(yōu)模型的R2和Q2.左側(cè)兩列的隨機(jī)實(shí)驗(yàn)數(shù)值的R2低于最優(yōu)模型的R2，Q2截距小于0，表明該模型未出現(xiàn)過(guò)擬合.圖2 大鼠血漿樣本正交偏最小二乘方判別分析及模型驗(yàn)證

2.3 輻射敏感代謝物的篩選

為篩選輻射敏感代謝物，將5 Gyγ射線照射組與對(duì)照組大鼠代謝物進(jìn)行比較，結(jié)合P＜0.05、VIP＞1，共篩選出11個(gè)潛在的差異代謝物(表2)，其中，丁酰基肉堿相對(duì)含量明顯上調(diào)；十八二烯酰基肉堿、2-甲基煙酰胺、十八一烯酰基肉堿、十六酰基肉堿、牛磺酸、煙酰胺、咪唑乙酸、己酰基肉堿、L-犬尿氨酸、胞嘧啶相對(duì)含量明顯下調(diào)。本研究分析了11個(gè)差異代謝物在各組的相對(duì)含量(表3)，并根據(jù)差異代謝物的相對(duì)含量進(jìn)行熱圖分析，用顏色的深淺代表含量的高低，紅色表示含量高，藍(lán)色表示含量低(圖3)。與對(duì)照組相比，十八二烯酰基肉堿、十八一烯酰基肉堿、十六酰基肉堿、己酰基肉堿、胞嘧啶在1、3、5 Gyγ射線照射組均顯著下調(diào)(P＜0.05)。此外，還分析了差異代謝物含量隨照射劑量的變化，十八二烯酰基肉堿、十八一烯酰基肉堿、十六酰基肉堿、牛磺酸、L-犬尿氨酸、胞嘧啶的相對(duì)含量隨照射劑量的上升而下降，符合線性方程模型(表4)。

2.4 代謝通路分析

為研究大鼠輻射損傷生物標(biāo)志物所涉及的代謝途徑和代謝物之間的關(guān)聯(lián)性，對(duì)11個(gè)具有顯著性差異的代謝物進(jìn)行通路富集分析。將所有差異代謝物進(jìn)行整合，尋找其關(guān)聯(lián)性并篩選出和輻射損傷最相關(guān)的代謝途徑(圖4)。結(jié)果顯示，大鼠受到γ射線全身照射后，損傷主要涉及牛磺酸和亞牛磺酸代謝、煙酸和煙酰胺代謝、初級(jí)膽汁酸生物合成等代謝通路。

表2 5 Gy 60Coγ射線照射后的大鼠血漿差異代謝物

表3 0～5 Gy 60Coγ射線照射后大鼠血漿差異代謝物的相對(duì)含量

圖3 大鼠受照后血漿差異代謝物熱圖分析

表4 大鼠血漿輻射敏感差異代謝物的劑量-效應(yīng)曲線

3 討論

A：牛磺酸和次牛磺酸代謝；B：煙酸和煙酰胺代謝；C：初級(jí)膽汁酸生物合成；D：色氨酸代謝；E：脂肪酸代謝.橫坐標(biāo)表示代謝通路的重要性，縱坐標(biāo)表示代謝通路富集分析的顯著性水平，代謝通路越靠近右上方表示可信性越高.圖4 大鼠受到60Coγ射線全身照射后差異代謝物通路富集分析結(jié)果

輻射可直接或間接對(duì)機(jī)體組織和細(xì)胞造成損傷，影響機(jī)體正常代謝活動(dòng)，導(dǎo)致基因突變，進(jìn)而引發(fā)一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)并導(dǎo)致機(jī)體代謝功能紊亂，過(guò)往已有研究利用代謝組學(xué)技術(shù)篩選生物標(biāo)志物，然而代謝物的變化在不用物種、不同樣本間差異較大[9-13]。為篩選輻射損傷代謝物，本研究以全身照射的大鼠為模型，利用基于LC-MS的代謝組學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)大鼠受照后血漿中11個(gè)代謝物發(fā)生了顯著變化，其中十八二烯酰基肉堿、十八一烯酰基肉堿、十六酰基肉堿、牛磺酸、L-犬尿氨酸、胞嘧啶的相對(duì)含量隨照射劑量的上升而下降，在0～5 Gy范圍內(nèi)，具有良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系(R2＞0.85)，這是成為輻射生物劑量計(jì)的基本條件。

在輻射損傷所涉及的代謝通路中，牛磺酸在牛磺酸代謝通路及初級(jí)膽汁酸生物合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、脂質(zhì)代謝和免疫功能以及維持細(xì)胞滲透壓等都具有顯著性影響，在肝臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等都具有極其重要的生理作用[14-15]。與對(duì)照組相比，照射組牛磺酸含量顯著性降低，提示電離輻射可能導(dǎo)致牛磺酸代謝紊亂，其病理原因可能是由于細(xì)胞滲透壓失調(diào)，減少能量供給，從而產(chǎn)生生理功能障礙。

煙酸和煙酰胺是脂質(zhì)代謝反應(yīng)體系輔酶的重要組成部分，煙酸是人體必需的維生素之一，在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為煙酰胺，煙酰胺是輔酶I和輔酶Ⅱ的組成部分，參與體內(nèi)脂質(zhì)代謝及糖類無(wú)氧分解等過(guò)程[16-17]。與對(duì)照組相比，照射組煙酰胺及2-甲基煙酰胺含量顯著性降低，可能與其脂質(zhì)代謝異常有關(guān)。

犬尿氨酸通路是色氨酸代謝的主要途徑，也是神經(jīng)退行性疾病及嚴(yán)重腦損傷中神經(jīng)元損傷的重要途徑。犬尿氨酸及其代謝產(chǎn)物的累積，在調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮重要功能，包括神經(jīng)活性及神經(jīng)毒性等[18]。本研究結(jié)果表明，照射組大鼠色氨酸代謝通路中的L-犬尿氨酸含量顯著變化，提示5 Gy60Coγ射線可能導(dǎo)致色氨酸代謝紊亂，進(jìn)而引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷。

綜上所述，采用代謝組學(xué)方法可篩選出一系列潛在的輻射敏感標(biāo)志物，其樣本容易獲得，并具有高通量等特點(diǎn)，是輻射生物劑量計(jì)研究的優(yōu)勢(shì)條件[3，19-20]。本研究以受到全身照射的大鼠作為損傷模型，發(fā)現(xiàn)電離輻射可導(dǎo)致大鼠血漿中代謝物發(fā)生顯著性變化，篩選出血漿中11個(gè)差異代謝物可作為潛在的輻射敏感標(biāo)志物，損傷主要涉及牛磺酸和亞牛磺酸代謝、煙酸和煙酰胺代謝、初級(jí)膽汁酸生物合成等代謝通路。本研究為輻射損傷生物標(biāo)志物提供了科學(xué)依據(jù)，下一步還將對(duì)已篩選出的差異代謝物進(jìn)行定量分析。