紫鉚花素抑制脂多糖誘導的骨髓源性巨噬細胞炎癥反應的研究

陳子卓，徐宇航，#，姜曉旭，趙九洲，朱敬樸，鄭義鵬，吳浩芝，李文麗，王 欣，*，海春旭，*，于衛華，*

(1．空軍軍醫大學基礎醫學院，陜西 西安710032；2．空軍軍醫大學第一附屬醫院綜合診療科，陜西 西安 710032；3．空軍軍醫大學軍事預防醫學院軍事毒理學與防化醫學教研室，陜西省自由基生物學與醫學重點實驗室，特殊作業環境危害評估與防治教育部重點實驗室，陜西 西安 710032)

紫鉚花素(butein)是一種由植物中分離提取的多酚類單體化合物，是傳統中草藥錦雞兒和降香的主要活性成分[1]。研究發現，紫鉚花素具有抗菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗纖維化和抗腫瘤等生物學效應，具有良好的藥物開發價值和前景[2]。脂多糖(lipo poly saccharide，LPS)是革蘭陰性菌細胞壁的重要活性成分，可與巨噬細胞膜上Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)結合，誘導巨噬細胞炎癥反應的發生。Janus激酶(Janus kinases，JAKs)是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，可在細胞因子作用下發生磷酸化，并通過信號轉導子和轉錄激活子(signal transducers and activators of transcription，STATs)啟動下游靶基因，發揮生物調控作用。STAT3是STATs家族的成員，可在胞漿內與多種細胞因子受體結合，進而轉移至核內發揮轉錄調控作用[3]。大量研究表明，JAK2-STAT3活化與細胞增殖、分化和免疫調節密切相關，在炎癥和腫瘤進展中發揮關鍵作用[4]。敲減JAK2和STAT3可阻斷多種炎癥因子誘導的巨噬細胞活化[5]。而在小鼠膿毒血癥模型中，使用JAK2-STAT3通路抑制劑，可有效阻斷核轉錄因子NFκB激活，提高小鼠的生存率[6]。最新研究發現，紫鉚花素是一種特殊的蛋白質酪氨酸激酶抑制劑，可顯著阻斷表皮生長因子受體磷酸化[7-8]。那么，JAK2作為一種酪氨酸蛋白激酶，是否受到紫鉚花素調控，目前并不清楚。因此，本研究旨在探討butein是否對LPS誘導炎癥具有抑制作用，及JAK2-STAT3通路在其中發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物和試劑 C57BL/6小鼠由第四軍醫大學動物中心提供；紫鉚花素標準品購自中國藥品生物制品中心，純度98%；LPS購自Sigma公司；H2DCFH-DA熒光探針購自Invitrogen公司；小鼠TNF-α、IL-6和NO酶聯免疫試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；iNOS、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3和βactin抗體均購自Birobyt生物公司；RMPI 1640培養液、胎牛血清、紅細胞裂解液、PBS均購自上海吉諾醫藥生物技術公司。

1.1.2 儀器 垂直流超凈工作臺購自ESCO公司，型號SCV-4A1；CO2培養箱為Thermo公司的3111/371型號；全波段酶標儀購自infinite公司，型號M200 PRO；流式細胞儀購自BD公司，型號Accuri C6；倒置顯微鏡購自Olympus公司，型號IX73；電泳儀、轉膜儀和凝膠成像系統均購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 骨髓源性巨噬細胞的分離培養 取8周齡小鼠脛骨和股骨，無菌環境中RMPI 1640培養基沖洗骨髓細胞。裂解紅細胞后，用40 ng/mL巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激7 d，分化為骨髓源性巨噬細胞(bone marrow-derived macrophages，BMDM)，通過貼壁篩選，獲得純化BMDM。采用含10%胎牛血清(FBS)的RMPI 1640培養基，置于CO2體積分數為5%的37℃恒溫培養箱中培養。

1.2.2 細胞處理以及實驗分組 BMDM采用500 ng/mL的LPS刺激12 h建立炎癥模型，受試物干預組使用5、10、20μmol/L的butein與LPS共處理，陰性對照組為20μmol/L的butein單獨處理12 h，并設立空白對照組，每組3個重復。

1.2.3 細胞培養基中TNF-α、IL-6和NO含量檢測采用ELISA法檢測培養基中TNF-α，IL-6和NO含量。細胞處理完成后，收集培養基，2 000 r/min離心10 min去除細胞。按照試劑盒說明書加入待測樣品和標準品，37℃環境下孵育2 h。清洗后加入檢測工作液，孵育30 min，酶標儀在450 nm波長下測定吸光度，并根據標準品吸光度曲線推算樣品中TNF-α和IL-6含量。

1.2.4 細胞ROS水平檢測 DCFH-DA是細胞內ROS測定的特異性熒光探針。DCFH-DA進入細胞后，可被水解為無熒光的DCFH，進而被ROS氧化為有熒光的DCF。DCF熒光越強，表明細胞內ROS水平越高。處理完成后，細胞中加入終濃度為10μmol/L的DCFH-DA，37℃環境下孵育30 min，流式細胞儀檢測熒光強度。

1.2.5 Western blot測定細胞內蛋白表達 細胞處理完成后，RIPA裂解液裂解細胞。BCA法進行蛋白定量，每組上樣20μg。選用10%凝膠，90 V電壓15 min，然后150 V電壓電泳約1 h結束。25 V、30 min條件下將凝膠蛋白轉至NC膜。5%BSA，37℃條件下封閉40 min。加入按要求稀釋的iNOS、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3和β-actin一抗，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min。加入1∶5 000稀釋的二抗，37℃孵育60 min。TBST洗膜4次，每次15 min。凝膠成像系統拍照。采用Quantity One軟件分析蛋白表達變化，并以對照組為基準進行標準化。計算p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3蛋白條帶灰度比值變化，并以對照組為基準進行標準化。

1.3 統計學方法

實驗數據以平均數±標準差表示，采用方差分析檢測組間方差是否齊性。兩組之間差異采用LSD t檢驗作比較，P＜0.05表示組間差異有統計學意義，數據統計分析采用SPSS 13.0軟件。

2 結果

2.1 紫鉚花素抑制LPS誘導的小鼠骨髓源性巨噬細胞促炎因子分泌

巨噬細胞在LPS等刺激下，可釋放大量促炎因子如TNF-α、IL-6、IL-1β等。ELISA檢測BMDM培養液中促炎因子濃度的結果見圖1A和圖1B。我們使用500 ng/mL的LPS刺激BMDM 12 h，ELISA法測定細胞上清中TNF-α和IL-6含量。結果發現，LPS刺激后BMDM培養基中TNF-α和IL-6濃度顯著升高(P＜0.05)。而5、10和20μmol/L的butein共處理后BMDM培養基中TNF-α和IL-6濃度明顯降低。其中，20 μmol/L的butein對TNF-α分泌的抑制率為68.6%，對IL-6分泌的抑制率為84%。

A：TNF-α濃度；B：IL-6濃度.n=3.與空白對照組比較，*P＜0.05；與LPS單獨處理組比較，#P＜0.05.圖1 ELISA法檢測小鼠骨髓源性巨噬細胞培養液中的促炎因子濃度

2.2 紫鉚花素抑制LPS誘導的小鼠骨髓源性巨噬細胞NO合成

NO在機體炎癥和免疫調節中發揮關鍵作用。在炎癥因子刺激作用下，巨噬細胞激活并釋放大量NO，具有殺菌和殺傷腫瘤細胞的作用。ELISA檢測BMDM培養液中NO濃度的結果見圖2A。LPS刺激下BMDM培養基中NO濃度顯著升高，而5、10和20 μmol/L的butein共處理顯著降低NO的合成(P＜0.05)。iNOS是巨噬細胞內調控NO合成的關鍵酶，iNOS表達和活性水平決定細胞NO的合成能力。Western blot檢測BMDM中iNOS表達水平的結果見圖2B，LPS活化BMDM的iNOS蛋白表達增加，而給予butein干預顯著降低iNOS表達(P＜0.05)。

2.3 紫鉚花素抑制LPS誘導的小鼠骨髓源性巨噬細胞ROS生成

在感染和炎癥條件下，巨噬細胞會釋放大量ROS，用于殺滅入侵病原菌。因此，ROS生成增多是M1型活化巨噬細胞的重要特征。DCFH-DA染色后流式細胞術檢測ROS生成的結果見圖3。LPS刺激下BMDM內DCF信號增強約30倍(P＜0.05)，表明LPS誘導BMDM生成ROS。而使用5、10和20μmol/L的butein共處理，DCF熒光曲線明顯左移(P＜0.05)，表明butein抑制了LPS誘導的ROS生成。

2.4 紫鉚花素抑制LPS誘導的小鼠骨髓源性巨噬細胞JAK2激活

A：ELISA法檢測細胞培養基中NO濃度；B：Western blot檢測細胞內iNOS蛋白表達.n=3.與空白對照組比較，*P＜0.05；與LPS單獨處理組比較，#P＜0.05.圖2 紫鉚花素抑制LPS誘導的小鼠骨髓源性巨噬細胞NO合成

A：流式細胞術檢測細胞培養基中DCFH-DA熒光強度；B：DCF平均熒光強度統計.n=3.與空白對照組比較，*P＜0.05；與LPS單獨處理組比較，#P＜0.05.圖3 紫鉚花素抑制LPS誘導的小鼠骨髓源性巨噬細胞ROS生成

JAK2是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，可在眾多細胞因子作用下激活，并通過STAT3啟動下游靶基因。Western blot檢測p-JAK2與JAK2表達水平的結果見圖4。LPS刺激下BMDM中JAK2蛋白表達無明顯變化，但p-JAK2表達增多，且p-JAK2與JAK2蛋白條帶灰度比值顯著升高(P＜0.05)。研究表明，紫鉚花素是一種酪氨酸激酶抑制劑。我們發現，與LPS組相比，butein共處理組p-JAK2表達降低，且p-JAK2/JAK2比值減少，以20μmol/L組最為明顯(P＜0.05)。

A：Western blot檢測細胞內p-JAK2和JAK2蛋白表達；B：p-JAK2/JAK2比值的統計分析.n=3.與空白對照組比較，*P＜0.05；與LPS單獨處理組比較，#P＜0.05.圖4 紫鉚花素抑制LPS誘導的小鼠骨髓源性巨噬細胞JAK2激活

2.5 紫鉚花素抑制LPS誘導的小鼠骨髓源性巨噬細胞STAT3激活

STAT3是細胞漿內重要的信號轉導和轉錄調節因子，在細胞因子刺激下STAT3磷酸化并轉位至細胞核，啟動下游靶基因轉錄。Western blot檢測內p-STAT3和STAT3表達水平的結果見圖5。LPS刺激下BMDM中p-STAT3表達增多，且p-STAT3與STAT3蛋白條帶灰度比值顯著升高(P＜0.05)。與LPS單獨處理組相比，butein共處理后BMDM內p-STAT3表達降低，且p-STAT3/STAT3比值減少，以20μmol/L組最為明顯(P＜0.05)。

A：Western blot檢測細胞內p-STAT3和STAT3蛋白表達；B：p-STAT3/STAT3比值的統計分析.n=3.與空白對照組比較，*P＜0.05；與LPS單獨處理組比較，#P＜0.05.圖5 紫鉚花素抑制LPS誘導的小鼠骨髓源性巨噬細胞STAT3激活

3 討論

炎癥與健康息息相關，一方面發揮免疫殺傷作用，可清除病原菌和惡性轉化細胞，另一方面通過損傷機體導致多種急慢性疾病。研究表明，90%以上臨床疾病均存在炎癥細胞的浸潤和炎癥反應的發生，例如感染、膿毒血癥、肥胖和腫瘤等[9-10]。巨噬細胞是體內最主要的炎癥效應細胞，廣泛存在于諸多組織和器官內。在脂多糖等致炎因子刺激作用下，巨噬細胞發生M1型極化。本研究通過分離小鼠骨髓，并使用GM-CSF誘導分化為BMDM[11]。在500 ng/mL的LPS刺激下，BMDM激活，并釋放一系列炎癥因子，包括TNF-α、IL-6和NO等。同時氧化應激與炎癥關系密切，巨噬細胞在炎癥因子刺激下可釋放大量ROS，而ROS可通過NFκB和COX2調控炎癥反應。我們在本研究中發現，LPS刺激下BMDM內炎性因子和ROS水平顯著升高，結果表明成功建立了LPS刺激BMDM的體外炎癥模型。

紫鉚花素是一種由中藥中提取的多酚類單體化合物，具有多種生物學活性[12]。大量研究表明，紫鉚花素具有抗菌、抗腫瘤、神經保護和心血管保護功能[13-14]。而有關紫鉚花素與炎癥相關研究較少，本研究中我們使用5、10和20μmol/L紫鉚花素與LPS共同處理BMDM 12 h。結果發現紫鉚花素可抑制LPS誘導的BMDM炎癥反應并呈劑量-效應關系，降低培養基中TNF-α、IL-6和NO含量。其中NO既是一種重要炎癥介質，又是一種活性較強的ROS，在體內具有重要生物學作用[15]。而NO合成依賴于iNOS，紫鉚花素抑制了iNOS的表達，進而降低了培養基中NO含量。此外，DCFH-DA染色結果也證實，紫鉚花素抑制了LPS誘導的巨噬細胞ROS生成。近年來研究表明，炎癥反應與氧化應激既存在交互作用，又存在獨立作用，因此單純抗炎或者抗氧化往往不足以根除炎癥[16]。因此，我們研究認為紫鉚花素兼具抗炎和抗氧化作用，是一種具有研究和開發價值的抗炎藥物。

JAK-STAT是細胞內重要的信號傳導和轉錄通路，可以通過與多種細胞因子和生長因子結合，參與機體細胞的增殖、分化、凋亡和免疫調節功能[17]。細胞因子與JAK受體結合后形成二聚體，并促進JAK的酪氨酸的磷酸化，活化的JAK可與STAT結合，引起STAT磷酸化以及核轉位，進而啟動下游靶基因轉錄[18]。近年來研究發現，JAK-STAT信號通路與巨噬細胞激活和炎癥反應密切相關[5]。敲減或抑制JAK2可顯著抑制脂多糖誘導的巨噬細胞TNF-α和IL-6表達。而JAK2可通過活化STAT3誘導巨噬細胞HMGB1和IL-6的轉錄表達，使用JAK2-STAT3通路抑制劑，可降低上述促炎因子的表達[19]。我們發現LPS刺激下BMDM中JAK2和STAT3的磷酸化顯著升高，表明該通路激活。紫鉚花素被認為是一種酪氨酸激酶抑制劑，而JAK2作為一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，紫鉚花素是否通過JAK2影響STAT3轉錄活性目前并不清楚。本研究表明紫鉚花素可顯著阻斷LPS活化BMDM的JAK2和STAT3的磷酸化。因此，我們認為紫鉚花素可能是通過JAK2-STAT3信號通路發揮抗炎效應。

綜上所述，紫鉚花素可顯著抑制LPS誘導的BMDM活化，降低炎癥因子和ROS生成。作為一種酪氨酸激酶抑制劑，紫鉚花素可能通過抑制JAK2-STAT3發揮抗炎效應。本研究證實紫鉚花素是一種新的抗炎候選藥物，為炎癥相關疾病防治提供了新的策略。