外源褪黑素對高溫脅迫下甜瓜幼苗抗氧化特性及其相關基因表達的影響

周永海，楊麗萍，馬榮雪，董亞萍，張 顯，馬建祥，李 好，魏春華，楊建強，張 勇

(西北農林科技大學 園藝學院，陜西楊凌 712100)

高溫脅迫影響著農作物正常的生長發育，隨著全球氣候變化，氣溫不斷升高，高溫脅迫是限制全球農作物生長的主要因素之一[1-2]。高溫脅迫對植物的傷害主要包括活性氧引起的氧化應激、蛋白質變性、酶失活、膜脂過氧化和核酸(DNA和RNA)損傷。植物已經進化出了防御系統，這些系統配備了不同的抗氧化成分來清除過量產生的活性氧從而保護植物免受氧化損傷。這些系統的重要的酶是抗氧化酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、谷胱甘肽還原酶(GR)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)[3-4]。除此之外，植物通過增加相關基因的表達從而保護植物免受傷害。一般來說，高溫脅迫導致了幾種熱誘導基因的上調，這些基因通常被稱為“熱休克基因”(HSPS)，編碼熱休克蛋白，這些活性產物對于植物在致命的高溫下生存是非常必要的[5]。高溫誘導的這些蛋白的表達大多通過蛋白折疊保護細胞內蛋白不變性，保持其穩定性和功能[6]。HSP可分為5個不同的基因家族，包括HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和HSP20。總之，植物通過提高這些酶的活性和抗逆基因的表達，維持體內自由基產生與清除間的動態平衡，從而使植物免受逆境傷害。

褪黑素(N-乙酰-5-甲氧基色胺)，是高度保守的并廣泛存在于植物體內。1958年，Lerner 等[7]首次從牛的松果體中提取出褪黑素，并證實它是一種類激素物質，參與動物的生長、發育調控和信號轉導，褪黑素是一種具有較強抗氧化作用的內源性自由基清除劑。由于其高親脂性，可輕易通過生物膜，可作為細胞內自由基清除劑。褪黑激素由于其部分親水性，可以通過細胞質進入細胞核，發揮抗氧化作用[8]。試驗表明，褪黑素可以直接清除·OH、H2O2、ONOO-、NO、LOO·等自由基[9]。

甜瓜是重要的經濟作物之一，近年來，甜瓜產業發展較快，是效益較好的經濟作物[10]。但夏秋季設施栽培中高溫往往是制約甜瓜設施栽培的主要限制因素。因此，本試驗通過預試驗確定適宜的褪黑素處理濃度，研究適宜濃度的外源褪黑素在高溫脅迫下甜瓜生理生化指標的變化特性，探討外源褪黑素誘導甜瓜幼苗耐熱性的可能機理，為夏秋季甜瓜設施栽培提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗設計

試驗于2019年3月至7月在西北農林科技大學園藝學院進行，供試品種為‘農大甜5號’，種子由西北農林科技大學園藝學院西甜瓜課題組提供。選取飽滿、大小一致的甜瓜種子，置于 28 ℃人工氣候箱內恒溫催芽12～24 h，種子露白后，播種于50孔穴盤育苗。置于RXZ智能型人工氣候箱(寧波江南儀器廠制造)，培養條件為；晝14 h(32 ℃)/夜10 h(20 ℃)光照度為8 000 lx，相對濕度為80%，待幼苗長至2片真葉時將幼苗移栽至營養缽(10 cm×10 cm)中，每隔2 d澆1次1/4 Hoagland營養液，每缽用量為20 mL。當幼苗長至三葉一心時挑選生長一致的幼苗進行處理，常溫下噴施蒸餾水作對照(CK)、高溫下噴施蒸餾水(HT)和高溫下噴施150 μmol/L的褪黑素(MTHT)。每個處理15株共重復3次，連續噴施3 d(以葉面欲滴又不滴水為宜)，然后在人工氣候箱內(光周期36 h，光照度8 000 lx)進行 43±1 ℃高溫處理，同時設置32 ℃的常溫對照(對照除與高溫處理溫度不同外，其余條件均一致)。處理36 h后統計熱害指數，并采集幼苗功能葉片和根(儲存于-80 ℃超低溫冰箱中)進行各種生理指標的測定。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 熱害指數的統計 熱害指數分級參照鄧嬌燕等[11]的方法，受害級別：0 級，生長正常，未受傷害；1 級，僅少數葉片邊緣有輕度的褶皺萎縮；2級，半數以下的葉片萎蔫死亡；3 級，半數以上的葉片萎蔫死亡；4 級，植株全部死亡。

熱害指數=∑[各株級數/(最高級數×總株數)]×100%

1.2.2 鮮質量含水量和根系活力的測定 每個處理隨機選取10株幼苗，用去離子水沖洗干凈，稱其鮮質量，然后將幼苗烘干至恒量，稱其干質量，鮮質量含水量=100×(鮮質量-干質量)/鮮質量×100%。根系活力采用TTC法測定[12]。

1.2.4 活性氧和抗氧化相關指標的測定 超氧化物歧化酶(SOD)采用氮藍四唑(NBT)還原法測定[15]，過氧化物酶(POD)活性采用愈創木酚顯色法測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外分光光度法測定。根據Wang等[16]方法測定抗壞血酸過氧化物酶(APX)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)和脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR) 活性。

1.2.5 RNA提取及熒光定量PCR分析 葉片總RNA用試劑盒(RNAsimple Total RNA ，Tiangen， Beijing)提取，總RNA反轉錄用(FastKing cDNA First Chain Synthesis Kit)試劑盒進行，得到cDNA模板。用Primer 6設計軟件設計qRT-PCR特異性引物，以甜瓜actin作為內參基因。特異性引物序列如表1所示。使用IQ5實時定量儀(Bio-rad, 美國)進行熒光定量分析，定量試劑盒選用SYBR○RPremix ExTap TMⅡ (2×)試劑盒(Takara, Tokyo, Japan)擴增PCR。反應體系中包含SYBR熒光染料10 μL， cDNA 模板0.8 μL，上下游引物各0.4 μL，ROX 0.2 μL最后用ddH2O補充至20 μL。PCR反應條件為95 ℃預變性3 min；95 ℃變性20 s、58 ℃退火 20 s、72 ℃延伸20 s，循環40次。

1.2.6 數據統計分析 采用GraphPad Prism軟件作圖，采用 SPSS 21.0 統計軟件分析數據，多重比較采用Duncan’s檢驗(P<0.05顯著水平)。圖表數據均為3次重復的平均值。

2 結果與分析

2.1 外源褪黑素對高溫脅迫下甜瓜幼苗含水量和熱害指數的影響

在高溫處理前3種處理的甜瓜幼苗形態一樣，高溫處理36 h后，與CK相比HT和MTHT鮮質量含水量均下降，分別下降5.09%和 2.21%，各處理之間差異顯著。高溫脅迫后，與CK相比HT和MTHT熱害指數均升高，但MTHT較HT熱害指數降低44.14%，MTHT明顯地緩解了高溫對植物生長的抑制作用 (表2)。

表1 熒光定量PCR擴增引物Table 1 Primers for fluorescence quantitative PCR amplification

表2 外源褪黑素處理及高溫脅迫下甜瓜幼苗含水量和熱害指數Table 2 Relative water content and heat damage index of melon seedlings under exogenous melatonin and high temperature stress

注：數值代表“平均值±標準差”。同列不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Each value represents the “mean±standard deviation”.The different lowercase letters in same column indicate significant difference(P<0.05).

2.2 外源褪黑素對高溫脅迫下甜瓜幼苗根系活力的影響

由圖1可以看出，高溫脅迫36 h后，與CK相比，MTHT甜瓜幼苗的根系活力升高，但差異不顯著，HT根系活力下降，HT與MTHT差異顯著。

2.3 外源褪黑素對高溫脅迫下甜瓜幼苗MDA質量摩爾濃度和產生速率的影響

2.4 外源褪黑素對高溫脅迫下甜瓜幼苗SOD、POD和CAT活性的影響

由圖3可以看出，甜瓜葉片SOD與CAT變化趨勢一致，與CK相比，HT的SOD和CAT活性分別下降11.28%和45.79%，MTHT提高SOD和CAT活性,分別比CK提高24.51%和25.71%，HT和MTHT差異顯著，CK與MTHT處理差異不顯著。高溫脅迫36 h后處理HT和MTHT均提高了POD活性，但CK與MTHT和HT差異顯著。

2.5 外源褪黑素對高溫脅迫下甜瓜幼苗抗壞血酸相關酶活性的影響

由圖4可以看出，甜瓜葉片DHAR和MDHAR變化規律一致，高溫脅迫顯著地降低了這2個酶的活性，高溫脅迫后，HT分別比CK降低20.27%和47.51%，褪黑素處理后幼苗在高溫脅迫下仍維持較高的抗壞血酸循環相關酶活性，DHAR活性較CK沒有顯著性差異，MDHAR活性較CK提高46.23%，高溫脅迫后HT和MTHT的APX活性均呈現上升趨勢，且各處理之間差異顯著。

圖中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

The different lowercase letters in the same figure indicate significant difference(P<0.05)，the same below

圖1 外源褪黑素處理及高溫
脅迫下甜瓜幼苗根系活力
Fig.1 Root activity of melon seedlings under exogenous
melatonin and high temperature stress

2.6 外源褪黑素對高溫脅迫下甜瓜幼苗抗逆基因表達的影響

為進一步地了解褪黑素響應高溫脅迫的分子機制，對3個蛋白保護(HSP70、HSP90和HSP101)基因和抗氧化酶(SOD和APX)基因進行表達量分析，結果如圖5所示：HSP70、HSP90、HSP101、SOD、APX基因表達量在高溫脅迫后均有不同程度的上調，HSP70、HSP90和HSP101與CK相比分別上調了12.69倍、44.42倍和287.20倍，HT處理后這3個基因分別上調了 2.72倍、14.03倍和63.97倍，HSP70與CK差異不顯著。SOD和APX表達分析結果顯示，與CK相比HTMT均顯著上調表達，HT與CK相比，有輕微的誘導，但與CK差異不顯著。

圖2 外源褪黑素處理及高溫脅迫下甜瓜幼苗MDA質量摩爾濃度和產生速率Fig.2 MDA molality and production rate in leaves of melon seedlings under exogenous melatonin and high temperature stress

圖3 外源褪黑素處理及高溫脅迫下甜瓜幼苗抗氧化酶活性Fig.3 Antioxidant enzymes activity in melon seedlings under exogenous melatonin and high temperature stress

3 討論與結論

高溫脅迫是最具有破壞性的環境脅迫之一。高溫脅迫后，植物生長受到不同程度的影響，表觀體現于形態結構變化上[10]。本試驗表明，高溫脅迫顯著的降低了甜瓜幼苗的相對含水量、熱害指數和根系活力，而外施褪黑素緩解了高溫對甜瓜幼苗造成的傷害。

圖4 外源褪黑素處理及高溫脅迫下甜瓜幼苗抗壞血酸相關酶活性Fig.4 Ascorba-related enzyme activity in melon seedlings under exogenous melatonin and high temperature stress

圖5 外源褪黑素處理及高溫脅迫下抗逆基因表達Fig.5 Expression of anti-stress genes under exogenous melatonin and high temperature stress

熱休克蛋白作為伴侶分子，是由熱脅迫誘導的，以保護細胞蛋白免受不可逆的熱誘導損傷[22]。 HSP70和HSP60蛋白是其中最保守的蛋白之一，在熱應激反應中起著重要作用[23]。在玉米中，ABA和HSP70的交互作用抵消了熱脅迫對蛋白質和酶的影響，保護它們不發生錯誤折疊和蛋白水解[24]。本試驗研究發現外源褪黑素處理后強烈地誘導HSP70、HSP90和HSP101的表達，從而增加HSPs的產生，保護宿主細胞免受熱休克引起的損傷。

綜上表明，外源褪黑素可以提高甜瓜的耐熱性并為甜瓜幼苗在熱脅迫下更好地生長提供了一種途徑。但要闡明褪黑素與HSP表達之間的關系及其增強翻譯還需要進一步研究。